血液脳関門における密着性結合(tight junction)再構築因子の検索

まず血液脳関門(BBB)in vitro再構築系を改良・開発し薬物の脳内移行率・BBB機能検定のスクーリニング・システム(BBBキット)を完成させるために、パーミアブルサポートの基本構造を、内皮細胞とアストロサイトの混合培養ができるパーミアブルサポートとして改良した。交流電気抵抗計を利用しBBBの機能のうち密着結合による透過性の検定、液相・吸着・受容体介在性エンドサイトーシスが測定できるようになった。また、ポリエステル、ポリカーボネートなど材質の検討、メンブレンフィルターのポアサイズ、コーティングの方法(フィブロネクチン)などハードの改良も完了した。細胞の選択も完了し、脳血液関門細胞株GP8.3細胞(SV40レトロビールス法で不死化されたラット脳毛細血管内皮細胞由来細胞株)、ラット初代培養ペリサイト(周囲細胞)、およびラット初代培養アストロサイトの3者で構築されるBBB in vitro再構築系(BBBキット)が機能的に最適であることを発見した。(1)内皮細胞のみ(2)内皮細胞とペリサイトの共培養(両細胞を接着させないもの)(3)内皮細胞とペリサイトの共培養(両細胞を接着させたもの)(4)ペリサイト接着共培養(3)にアストロサイトを加えたもの、4種の細胞の組み合わせのキットで、タイトジャンクション(密着結合)構成タンパクのoccludinとZO-1のタンパク発現量とmRNAを定量したところ、(4)の組み合わせが共に最多の発現量であった。ペリサイトの特異なBBBの作用を発見し、脳内への薬剤の移行検定に役立つ検査キットを作成した。

まず血液脳関門(BBB)in vitro再構築系を改良・開発し薬物の脳内移行率・BBB機能検定のスクーリニング・システム(BBBキット)を完成させるために、パーミアブルサポートの基本構造を、内皮細胞とアストロサイトの混合培養ができるパーミアブルサポートとして改良した。交流電気抵抗計を利用しBBBの機能のうち密着結合による透過性の検定、液相・吸着・受容体介在性エンドサイトーシスが測定できるようになった。また、ポリエステル、ポリカーボネートなど材質の検討、メンブレンフィルターのポアサイズ、コーティングの方法(フィブロネクチン)などハードの改良も完了した。細胞の選択も完了し、脳血液関門細胞株GP8.3細胞(SV40レトロビールス法で不死化されたラット脳毛細血管内皮細胞由来細胞株)、ラット初代培養ペリサイト(周囲細胞)、およびラット初代培養アストロサイトの3者で構築されるBBB in vitro再構築系(BBBキット)が機能的に最適であることを発見した。(1)内皮細胞のみ(2)内皮細胞とペリサイトの共培養(両細胞を接着させないもの)(3)内皮細胞とペリサイトの共培養(両細胞を接着させたもの)(4)ペリサイト接着共培養(3)にアストロサイトを加えたもの、4種の細胞の組み合わせのキットで、タイトジャンクション(密着結合)構成タンパクのoccludinとZO-1のタンパク発現量とmRNAを定量したところ、(4)の組み合わせが共に最多の発現量であった。ペリサイトの特異なBBBの作用を発見し、脳内への薬剤の移行検定に役立つ検査キットを作成した。