脳内胆汁酸の由来の解明とその生理的意義解明に関する研究

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胆汁酸は、肝においてコレステロールより生合成され、腸肝循環する炭素数24個のカルボン酸であり、その生合成や動態は厳密に制御されているため、通常血中や末梢組織中にはごく僅かにしか存在しない。最近、LC/ESI-MSを用いてラット脳組織中の胆汁酸の検索を行ったところ、可溶性画分中に3種の遊離型胆汁酸の存在することが明らかとなった。しかもそれらのうち、ケノデオキシコール酸はグアニジン塩酸塩を用いる蛋白質変成操作を加えることにより初めて検出されることから、脳内においてある種の蛋白質と強くバウンドしていることが示唆された。そこで今回、ケノデオキシコール酸を固定化したアフィニティーゲルを調製し、これを用いて結合蛋白質の特異的抽出を試みるとともに、プロテオミクス手法を用いてその結合蛋白質の解析を行った。まず、ケノデオキシコール酸のβ-アラニン抱合体を調製し、これをカルボジイミド法を用いてアガロースゲルに固定化した。これに、ラット脳細胞質画分を添加し、緩やかに混合してケノデオキシコール酸結合蛋白質を捕捉した。次いで、リン酸緩衝液、水/メタノール混液などを用いて順次洗浄して非特異的結合蛋白質を除去した。先と同様に高濃度のグアニジン塩酸塩溶液を添加してケノデオキシコール酸と強く結合した蛋白質をアンフォールドすることによって抽出し、得られた蛋白質混合物を二次元ゲル電気泳動法を用いて分離したところ、数種の蛋白質が特異的に濃縮されることが判明した。トリプシンを用いるゲル内消化後、MALDI-TOFMSによるペプチドマスマッピングに付し、ペプチドマスフィンガープリンティング法によるデータベース検索を行ったところ、ビタミンD依存性Ca結合蛋白質の他、チューブリンや14-3-3蛋白質ζなどのアルツハイマー病に関与する蛋白質が同定された。