プロテオーム解析の高速化と高性能化を指向したシリカ連続体カラムの開発

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本研究課題の目的は、タンパク質の高速・高性能分離である。これには、逆相型カラムの他にイオン交換型カラムやサイズ排除型カラム、アフィニティ型カラムが必要とされる。これらの機能をシリカモノリス型カラムに付与するために、種々のシランを用いてオンカラム反応によるシリカ骨格の表面修飾法を確立することである。今年度は、イオン交換型、サイズ排除型の機能を有するシリカモノリス型カラムの調製法を種々検討し、表面修飾の方法を確立し、標準タンパク質サンプルへの適用を行った。(1)3-ジエチルアミノ-2-ヒドロキシプロピルメタクリレートをラジカル重合することにより陰イオン交換型カラムを作成した。電子顕微鏡での観察結果より、重合後は明らかにシリカ骨格が太くなっていることがわかった。このカラムでヌクレオチド(5'-UMP、5'-CMP、5'-AMP、5'-GMPの4種)の分離を試みた。これらは効率よく分離された。参考にした市販カラム(Shodex AXpack WA-624)の分析例とほぼ一致した。シリカモノリスキャピラリーカラムの方は分離性能が格段に優れでいることがわかった。30センチ程度のカラムで5'-CMPや5'-UMPでは、それぞれ理論段数25000段が得られている。また、市販カラムは60度の分離条件で比較的良い理論段数を得ているのに対し、シリカモノリスキャピラリーカラムは室温で高理論段数が得られているのも大きな特徴の一つであることが示された。(2)1と同様にアクリルアミドを重合することによって、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを調製した。移動相にリン酸緩衝液(pH7.1)を用いて分子量キャリブレーション用の10種のタンパク質(分子量1万2千〜40万)の分離を行なったところ、溶出はおおむね分子量の大きいものから小さいものの順番で起こった。シリカ骨格へのタンパク質の非特異的な吸着が抑えられているものと考えられるが、完全なサイズ排除条件での分析には至っていないのが現状である。