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枯草菌細胞表層蛋白質の安定性及び局在性における分泌プロテアーゼの影響

分泌蛋白酶对枯草芽孢杆菌细胞表面蛋白稳定性和定位的影响

基本信息

批准号：
14760046
负责人：
山本博規
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

枯草菌における細胞表層蛋白質には、プロテアーゼや細胞壁溶解酵素を含む約20の蛋白質が存在する。7種類の分泌プロテアーゼ多重欠損株を用いた細胞表層蛋白質のプロテオーム解析により、主要な細胞表層蛋白質であるWapAのプロセッシングがEprによりなされていることを明らかにした。また栄養増殖期の細胞壁溶解酵素について3xFLAGエピトープtagを融合させ、免疫蛍光顕微鏡観察を行った結果、D, L-endopeptidaseであるLytF及びLytEは分裂面及び分裂後の極に局在し、細胞分裂の最終段階である細胞分離に機能している可能性が推測された。一方amidaseであるLytCは細胞表層にほぼ均一に分布していた。次に分泌プロテアーゼによる細胞表層蛋白質の分解を検出するために、3xFLAG融合蛋白質こついてWestern blot解析及びzymographyを行った。その結果、LytF及びLytEは表層プロテアーゼWprA及びEprにより分解を受けるのに対し、LytCはほとんど分解を受けないことが解った。さらにこの3xFLAGシステムを用いて、網羅的な細胞表層蛋白質の局在性並びに分泌プロテアーゼによる分解の有無を調べた。その結果、LytCのmodifierであるLytB、及びglucosaminidaseであるLytDはLytCと同様に細胞表層にほぼ均一に分布することが明らかになった。またD, L-endopcptidaseであるYojL、及び機能未知蛋白質であるYoeBは分裂面及び分裂後の極に局在し、同様に機能未知蛋白質であるYqgAは分裂面のみに局在することが解った。さらにWestern blot解析の結果、LytBはWprA及びEprによりほとんど分解を受けなかったのに対し、LytD、YojL、YoeB、及びYqgAは両プロテアーゼにより分解を受けることが明らかになった。また細胞表層蛋白質の安定性に影響を及ぼすことが明らかになった細胞表層プロテアーゼであるWprAに関してその局在部位を観察したところ、培地中の塩濃度が低い(NaCl濃度0.5%以下)場合には細胞の両極に局在し、塩濃度が高い(NaCl濃度1%以上)場合には細胞表層にほとんど局在できず培地中に遊離してしまうことが解った。さらに分裂面及び分裂後の両極に見られるLytFの局在性は、細胞壁の構成成分であるpeptidoglycanを特異的に認識することによりなされている可能性が示唆された。

Subtile cell surface proteins contain about 20 proteins. 7 kinds of secretion of protein in cell surface layer protein analysis, main protein in cell surface layer protein analysis, protein in cell surface layer protein analysis The fusion of 3xFLAG and tag in cell wall lytic enzymes during growth, the results of immunoluminescence microscopy, the possibility of LytF and LytE in mitotic plane and postmitotic pole, and the function of cell separation in the final stage of cell division were speculated. LytC is uniformly distributed on the surface of cells. Western blot analysis and zymography of 3xFLAG fusion protein The results of LytF and LytE are as follows: In addition, the 3xFLAG system is used to collect the surface protein of the cell, and the secretion of the protein is not regulated. LytC and glucosaminase are uniformly distributed on the surface of cells. YojL, L-endopcptidase, and protein of unknown function YoeB split surface and polar region after split, protein of unknown function YqgA split surface and polar region after split. The results of Western blot analysis, LytB, WprA, YojL, YoeB, and YqgA were analyzed. The stability of cell surface protein is affected by the concentration of NaCl in culture medium and low (NaCl concentration less than 0.5%), and the stability of cell surface protein is affected by the concentration of NaCl in culture medium and high (NaCl concentration more than 1%). In addition, the division surface and the post-division polar surface can be seen in the structure of LytF, the composition of the cell wall, and the possibility of understanding the specific structure of LytF.