キノプロテイン-アミン脱水素酵素触媒反応メカニズムの解析

今年度の研究においては、昨年度から取り組んでいるグラム陽性細菌Noncardioides smiplex IFO 12069の可溶性画分から精製したヒスタミン脱水素酵素(HmDH)について、HmDHを用いた新しいヒスタミンバイオセンサー(HmDH機能電極)、ならびに、HmDH機能電極を検出部位としたヒスタミンに対するフローインジェクションアナリシス(FIA)システムの開発・検討を実行した。昨年度の報告書にも記述したように、グラッシーカーボン電極表面に、HmDHと電子伝達メディエーターであるオスミウム錯体の両方を固定化した機能電極を作成し、新たにFIAシステムの検出部位とした。実サンプル中に存在すると考えられるアスコルビン酸による妨害を取り除くため、ヒスタミン検出部位の上流に前処理部位を取り付けた。食品分析の現場での利用を想定し、実サンプルを用いた特性評価を行ったところ、通常用いられるHPLC-蛍光検出法と比較して、分析時間の短縮を達成すると同時に分析値の高い相関性が観測され、本FIAシステムが現場で利用可能であることを示した。一方、新たなアミン脱水素酵素としてAlcaligenes xylosoxidans IFO 13495より見い出されたアミン脱水素酵素について、その基本特性の検討も行った。既に報告されているAlcaligenes faecalis IFO 14479由来の芳香族アミン脱水素酵素と比較して、基質特異性に似かよった傾向があるが必ずしも一致しない。また、中性溶液における総電荷は大きく異なる。現在、本酵素の活性中心の構造、ならびに菌体内での電子伝達反応について、引き続き検討を行っている。

今年度の研究においては、昨年度から取り組んでいるグラム陽性細菌Noncardioides smiplex IFO 12069の可溶性画分から精製したヒスタミン脱水素酵素(HmDH)について、HmDHを用いた新しいヒスタミンバイオセンサー(HmDH機能電極)、ならびに、HmDH機能電極を検出部位としたヒスタミンに対するフローインジェクションアナリシス(FIA)システムの開発・検討を実行した。昨年度の報告書にも記述したように、グラッシーカーボン電極表面に、HmDHと電子伝達メディエーターであるオスミウム錯体の両方を固定化した機能電極を作成し、新たにFIAシステムの検出部位とした。実サンプル中に存在すると考えられるアスコルビン酸による妨害を取り除くため、ヒスタミン検出部位の上流に前処理部位を取り付けた。食品分析の現場での利用を想定し、実サンプルを用いた特性評価を行ったところ、通常用いられるHPLC-蛍光検出法と比較して、分析時間の短縮を達成すると同時に分析値の高い相関性が観測され、本FIAシステムが現場で利用可能であることを示した。一方、新たなアミン脱水素酵素としてAlcaligenes xylosoxidans IFO 13495より見い出されたアミン脱水素酵素について、その基本特性の検討も行った。既に報告されているAlcaligenes faecalis IFO 14479由来の芳香族アミン脱水素酵素と比較して、基質特異性に似かよった傾向があるが必ずしも一致しない。また、中性溶液における総電荷は大きく異なる。現在、本酵素の活性中心の構造、ならびに菌体内での電子伝達反応について、引き続き検討を行っている。