好塩性酵素を産業に生かす

在工业中利用嗜盐酶

• 批准号: 14760211
• 负责人: 石橋 松二郎
• 金额: $ 2.43万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760211/
• 关键词: 高度好塩菌; 好塩性酵素; ヌクレオシド二リン酸キナーゼ; folding

高度好塩菌Halobacterium salinarum由来nucleoside diphosphate kinase (HsNDK)は大腸菌内で発現したが、培地1Lあたり0.5mgと少量でしかも濃い塩に一旦さらさないと活性は無かった。しかし、His-tagフラグメントを付加したHisHsNDKは培地1Lあたり30mgと大量に発現した。しかもHisHsNDKは酵素活性を保持した状態で発現した。これは高度好塩菌由来の酵素が通常生物である大腸菌内で発現した最初の例である。In vitroの系でも変性後の巻き戻りがHis-tagの付加により促進された。また、HsNDKは3.8 M NaCl存在下でのみ6量体だがHisHsNDKは0.2 M,3.8 M NaClどちらの存在下でも6量体が存在した。6量体の安定化や高濃度塩存在下での巻き戻りは塩による負電荷の遮蔽が関係しているのではないかと考え,Trimethylamine N-oxide(TMAO)存在下でのリフォールディング実験を行った。HsNDKは4Mの濃度でかつ、その時のpHがpH8.0以上では巻き戻らなかった。これはHsNDKの負電荷どうしが反発をおこした為だと考えられた。それ故負電荷遮蔽の目的で薄いNaClを加えるとpH8.0以上でもHsNDKは巻き戻った。一方,HisHsNDKは4 M TMAO(pH8.3)存在下でも巻き戻る事が出来た。この事はpH8.0以上でもHisHsNDKのHis-tagフラグメントが負電荷を遮蔽し,負電荷どうしの反発を抑え,巻き戻りを促進させたことを示唆している。この事よりHisHsNDKの大腸菌内での活性化,巻き戻り効率の促進,6量体の形成はHis-tagフラグメント中の6個のHisと1個のArgによる重要な部位の負電荷の遮蔽によるものだと推察された。

Halobacterium salinarum is a highly pathogenic bacterium derived from nucleoside diphosphate kinase (HsNDK). It is found in Escherichia coli and cultured in 1L. It has a small amount of 0.5 mg and no activity. HisHsNDK was found in large quantities at a dose of 30mg per 1L. His NDK enzyme activity remains active. This is the first example of a highly pathogenic bacterium. In vitro, the system is flexible and the system is easy to use. In the presence of 3.8 M NaCl, HsNDK is present in 6 volumes. 6. In the presence of trimethamine N-oxide(TMAO), the negative charge shielding effect was observed. HsNDK has a concentration of 4M, and its pH is above pH8.0. The negative charge of HsNDK is reduced to zero. For negative charge shielding purposes, increase in NaCl above pH 8.0 On the other hand,HisHsNDK 4 M TMAO(pH8.3) exists. For those above pH 8.0, HisHsNDK's His-tag is used to mask negative charges, suppress negative charges, and promote negative charges. The activation of HisHsNDK in Escherichia coli, the promotion of efficiency, the formation of 6 quantities of His-tag, the shielding of negative charges in important parts of HisHsNDK, and the detection of negative charges in important parts of HisHsNDK.

项目成果

石橋 松二郎: "Activation of Halophilic Nucleoside Dipohosphate Kinaze by a Non-ionic Osmolyte, Trimethlamine N-Oxide"J.Pro.Chem.. 22(4). 345-351 (2003)

Matsujiro Ishibashi：“非离子渗透剂 Trimethlamine N-Oxide 激活嗜盐核苷二磷酸激酶”J.Pro.Chem.. 22(4) (2003)。

徳永 正雄: "好塩菌のヌクレオシド二リン酸キナーゼは変わり者?"化学と生物. 41巻1号. 5-7 (2003)

Masao Tokunaga：“嗜盐细菌的核苷二磷酸激酶不寻常吗？”化学与生物学，第 41 卷，第 1. 5-7 期（2003 年）。

石橋 松二郎: "SALTING-IN EFFECTS OFFSET MGCL2-INDUCED REFOLDING OF NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE"Prptein and Peptide Letters. 10(6). 575-580 (2003)

Matsujiro Ishibashi：“盐入效应抵消 MGCL2 诱导的核苷二磷酸激酶的重新折叠”蛋白质和肽快报 10(6) (2003)。

石橋 松二郎: "Secondary and quaternary structual transition of the halophilic archaeon nucleoside diphosphate kinase under high- and low-salt conditions"FEMS Microbiology Letters. 10697. 1-7 (2002)

Matsujiro Ishibashi：“高盐和低盐条件下嗜盐古菌核苷二磷酸激酶的二级和四级结构转变”FEMS 微生物学快报。10697. 1-7 (2002)。

石橋 松二郎: "Secondary and quaternary structual transition of the halophilic archaeon nucleoside diphosphate kinase under high-and low-salt conditions"FEMS Microbiology Letters. 10697. 1-7 (2002)

Matsujiro Ishibashi：“高盐和低盐条件下嗜盐古菌核苷二磷酸激酶的二级和四级结构转变”FEMS微生物学快报。10697.1-7(2002)。