NF-IL6の転写活性化様式とそのアイソフォームの機能解析

転写因子NF-IL6はエクソン内に3つの転写開始点を有しそれぞれの転写開始点からFull, LAP, LIPの3つのアイソフォームができる。今年度は各々のアイソフォームの機能を解析する目的で、それぞれの転写開始点のメチオニンに変異を加えたマウスを作成した。マウスのNF-IL6のcDNAのメチオニンにPCRによって点変異を加えた。NF-IL6のエクソンを変異を加えたエクソンに置換しその下流にプロモーター付きneo耐性遺伝子を挿入したターゲッティングベクターを胚性幹細胞(ES細胞)に導入し相同組み換え体を得た。このES細胞をマウス胚にinjectionしキメラマウスを作成する。得られた雄キメラマウスを雌のC57BL/6マウスと交配することにより目的遺伝子の片アレルを持つヘテロノックインマウスを得、さらにこれを掛け合わせ量アレルに変異を持つホモノックインマウスを作成した。各ノックインマウスにおいて、各アイソフォームの発現の変化を調べている。また各ノックインマウスにおいてサイトカイン産生や細菌感染時のTh1反応、細胞内寄生菌に対する抵抗性、DNAマイクロアレイによって遺伝子発現の変化を検討している。これとは別に、カリフォルニア大学のModlin R.L.らとの共同研究により、らい菌がToll-like receptor(TLR)1とTLR2のヘテロダイマーによって認識され、類結核型の病巣ではTLR1とTLR2の発現が上昇しており、らい菌に対する感染防御にTLR1とTLR2が深く関わっていることを明らかにした。この成果は論文として発表された。(Krutzik S.R.,et al.Activation and regulaton of Toll-like receptors 2 and 1 in human leprosy.Nat Med.2003 May;9(5):525-32)さらに、当研究室においてTLRのシグナル伝達に関わるアダプター分子TRIF-related adaptor molecule(TRAM)、のノックアウトマウスの作製、解析に参加した。TRAMのノックアウトマウスではTLR4を介するサイトカイン産生が特異的に障害されていた。またTLR3ではなくTLR4を介するインターフェロンベータやインターフェロン誘導性遺伝子の発現が障害していた。これより、TRAMがTLR4のMyD88非依存的な経路に特異的に関わるアダプター分子であることを明らかにした。これらの結果は論文として発表された。(Yamamoto et al.,T RAM is specifically involved in the Toll-like recepotor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway.Nat Med.2003 May;9(5):525-32.)

転写因子NF-IL6はエクソン内に3つの転写開始点を有しそれぞれの転写開始点からFull, LAP, LIPの3つのアイソフォームができる。今年度は各々のアイソフォームの機能を解析する目的で、それぞれの転写開始点のメチオニンに変異を加えたマウスを作成した。マウスのNF-IL6のcDNAのメチオニンにPCRによって点変異を加えた。NF-IL6のエクソンを変異を加えたエクソンに置換しその下流にプロモーター付きneo耐性遺伝子を挿入したターゲッティングベクターを胚性幹細胞(ES細胞)に導入し相同組み換え体を得た。このES細胞をマウス胚にinjectionしキメラマウスを作成する。得られた雄キメラマウスを雌のC57BL/6マウスと交配することにより目的遺伝子の片アレルを持つヘテロノックインマウスを得、さらにこれを掛け合わせ量アレルに変異を持つホモノックインマウスを作成した。各ノックインマウスにおいて、各アイソフォームの発現の変化を調べている。また各ノックインマウスにおいてサイトカイン産生や細菌感染時のTh1反応、細胞内寄生菌に対する抵抗性、DNAマイクロアレイによって遺伝子発現の変化を検討している。これとは別に、カリフォルニア大学のModlin R.L.らとの共同研究により、らい菌がToll-like receptor(TLR)1とTLR2のヘテロダイマーによって認識され、類結核型の病巣ではTLR1とTLR2の発現が上昇しており、らい菌に対する感染防御にTLR1とTLR2が深く関わっていることを明らかにした。この成果は論文として発表された。(Krutzik S.R.,et al.Activation and regulaton of Toll-like receptors 2 and 1 in human leprosy.Nat Med.2003 May;9(5):525-32)さらに、当研究室においてTLRのシグナル伝達に関わるアダプター分子TRIF-related adaptor molecule(TRAM)、のノックアウトマウスの作製、解析に参加した。TRAMのノックアウトマウスではTLR4を介するサイトカイン産生が特異的に障害されていた。またTLR3ではなくTLR4を介するインターフェロンベータやインターフェロン誘導性遺伝子の発現が障害していた。これより、TRAMがTLR4のMyD88非依存的な経路に特異的に関わるアダプター分子であることを明らかにした。これらの結果は論文として発表された。(Yamamoto et al.,T RAM is specifically involved in the Toll-like recepotor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway.Nat Med.2003 May;9(5):525-32.)