細胞内蛋白質の活動の可視化を目指した蛍光性バイオセンサー構築

构建用于细胞内蛋白质活性可视化的荧光生物传感器

基本信息

批准号：
03J08766
负责人：
清中茂樹
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University (2004-2005)Okazaki National Research Institutes (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度は、アフィニティーラベル化後修飾法を作用部位が不明確な薬の作用部位同定法として応用できることを報告した。今年度は、その手法の一般性を確認するために、我々が新たに同定した従来とは異なる作用を有する免疫抑制剤の作用部位同定にこの手法を応用した。まず、免疫抑制剤の作用部位をある程度推測するために、カルシウムイオンの流入阻害について検討した。カルシウムイメージングを利用した結果からこの薬が受容体刺激後のCa2+流入を阻害することを確認できた。流入経路はTRPCチャネルと呼ばれるチャネルであると考えられたので、各サブタイプに対する選択性についてHEK293細胞を用いた評価した。その結果、この薬はTRPC3のチャネル活性を選択的に抑制できることを見出せた。さらにホールセルモードのパッチクランプ法を用いることで、細胞外からこの薬はチャネル活性を阻害することも確認できた。TRPC3に直接この薬が作用していることを証明するために、本申請内容で提案したアフィニティーラベル化後修飾法を利用した。具体的には、この薬に対応するアフィニティーラベル化剤を有機合成し、TRPC3を過剰発現させたHEK293細胞に作用させた。光照射後に細胞膜画分を回収し、ラベル化後の選択的な修飾反応としてビオチン修飾を行った。反応進行をウェスタンブロッティングにて確認したところ、TRPC3に選択的に反応していることを確認でき、この免疫抑制剤がTRPC3に直接結合している証拠を得ることができた。以上の結果から、本手法の一般性を確認することができた。

去年，我们报告说，亲和力标记修饰方法可以作为识别具有不清楚作用部位的药物的作用部位的方法。今年，为了确认这种方法的一般性，我们应用了此方法来识别与我们新确定的传统抑制剂不同的免疫抑制剂作用部位。首先，为了估算一定程度的免疫抑制剂作用部位，研究了钙离子的抑制作用。使用钙成像，我们确认该药物抑制受体刺激后CA2+流入。由于流入途径被认为是称为TRPC通道的通道，因此使用HEK293细胞评估每个亚型的选择性。结果，发现该药物可以选择性抑制TRPC3的通道活性。此外，通过使用全细胞模式贴片夹法，可以证实该药物抑制细胞外部的通道活性。为了证明该药物直接作用于TRPC3，我们使用了本应用程序中提出的亲和力标记修改方法。具体而言，与该药物相对应的亲和力标记剂有机合成并作用于过表达TRPC3的HEK293细胞。光照射后，收集细胞膜馏分，并在标记后将生物素修饰为选择性修饰反应。当通过蛋白质印迹确认反应进展时，已证实它对TRPC3有选择地反应，并证明该免疫抑制剂直接与TRPC3结合。从以上结果可以证实该方法的一般性。