アフラトキシン生産阻害物質アフラスタチンAの作用機作の解明

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(1)アフラスタチン結合タンパク質(AsBP)の探索アフラスタチンAの作用機構を解析する上で、アフラスタチンAがアフラトキシン生産菌A.parasiticusの菌体内で結合するタンパク質を同定することが重要であると考え、アフラスタチンAの類縁体であるブラストサイジンAにアリルアジドとビオチンを導入したフォトアフィニティラベル用誘導体を調製した。菌体抽出液にこの誘導体を加えた後、紫外線を照射してラベルを行い、HRP-avidinを用いたウェスタンブロッティングを行って、AsBPの検出を試みたが、誘導体によって特異的にラベルされるタンパク質は見いだせなかった。今後、ラジオアイソトープなど他の検出法を用いた系について検討する必要があると考えられる。(2)アフラスタチンAの作用機構とビオチン酵素の関連これまでの予備的な実験の結果から、アフラスタチンAがビオチン酵素にビオチンを結合させる酵素であるビオチンアポプロテインリガーゼ(BPL)を阻害しているという可能性が示唆されていた。そこで、アフラスタチンAがBPLの活性に与える影響をin vitroで調べるために、BPL活性検定系の構築を試みた。基質として出芽酵母S.cerevisiaeのピルビン酸カルボキシラーゼのビオチン化部位を含むペプチドを大腸菌に発現させることによって得た。さらに、A.parasiticusのcDNAライブラリからBPLをコードした遺伝子をクローニングした。この遺伝子を大腸菌タンパク質発現用ベクターに導入し、大量発現を試みた。しかし、培養条件、誘導条件、発現ベクターなどを検討した結果、現時点では活性を有する形でBPLを得る条件を見出すことができていない。今後、リフォールディングなどを含めたさらなる条件検討が必要であると考えられる。