ヒト・マウス培養細胞及びマウス個体におけるRNAi関連遺伝子の機能解析

点击翻译按钮获取中文摘要

平成16年度は、ヒトのDicer(hDcr)及びeIF2C1(h2C1)の分子解析を行った。先ず大腸菌での発現系を検討したところ、完全長蛋白質の大量発現は困難であったが、部分断片蛋白質は可能であった。h2C1のRNAiに特徴的なドメインとして同定されている機能不明なPAZドメインについて、RNAとDNAに対する結合活性をゲルシフト分析で試験したところ、その活性はRNAに特徴的で、一本鎖RNAに対して弱く結合し、二本鎖RNAの3'末端2塩基以上の突出構造を認識し、強く結合することが見い出された。このことから、PAZドメインは二本鎖siRNAのみならず、ターゲットmRNAとsiRNAアンチセンス鎖のハイブリッド中間体をも、限定的に認識するであろうと推察された。また、hDcr全長について、バキュロウイルスによる発現を検討したところ、可溶性で発現可能であった。精製して得られたhDcrは二量体で、長い二本鎖RNAからsiRNAを生成する活性を有していた。この切断活性は明らかに、1つのRNaseIIIドメインだけからなるC末部分断片hDcrの活性と異なっていた。欠失体解析の結果、hDcrのsiRNA生成活性の発現にはN末のヘリカーゼドメインは必要でないが、PAZドメインと2つのRNaseIIIドメインを含むC末側が必要であることが見い出された。これらの結果から、siRNAサイズ21塩基の分子物差し様式は、PAZドメインが二本鎖RNAの3'末端2塩基突出構造を認識して、そこから21塩基離れた部位を2つのRNaseIIIドメインから成る分子内ヘテロ二量体活性中心が切断することに生じると推察された。