植物プランクトンにおけるアラニンラセマーゼの生状および一次構造解析

浮游植物中丙氨酸消旋酶的生物学和一级结构分析

• 批准号: 15780143
• 负责人: 横山 雄彦
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15780143/
• 关键词: アラニンラセマーゼ; D-アラニン; タンパク質; 珪藻; 植物プランクトン; 精製

本年度は,珪藻Thalassiosira gravidaを材料としてアラニンラセマーゼの単離・精製を試み,一次構造解析を行った。まず,Toyopearl Butyl-650M(Tosoh)で2つの活性ピークが得られ,このうち,疎水性の強い画分はHydroxyapatite(Bio-Rad)で,さらに2つの活性ピークに分かれたため,合計3つの活性ピークが認められた。これらの精製酵素の化学的性状を調べた結果,いずれも最適pHが9.0付近,D-およびL-Alaのみを特異的に基質とすること,活性発現にピリドキサール5'-リン酸(PLP)の新たな添加を必要としないが,PLP酵素阻害試薬により阻害されることなどの性質が類似していた。また,サブユニットの分子量はいずれも38kDa付近で,2量体であることも類似していた。これらの物理化学的性状が非常に類似していたため,これらの活性ピークの相違を明らかにするためには,一次構造配列まで踏み込んで解析する必要があると考えられた。そこで,精製酵素について,N末端配列解析を行った結果,いずれも残念ながらN末端はブロックされていた。そこで,最も活性の高かった活性ピーク(Butylで分かれた疎水性の強い画分をさらにHydroxyapatiteで分けた活性ピークのうち,10mMリン酸カリウム(pH6.8)で溶出された画分)について,リシルエンドペプチダーゼ(Wako)消化後,逆相クロマトグラフィー(ODS-120T:Tosoh)によりペプチドを分取し,ペプチドマップを作成後,気相プロテインシーケンサー(Shimadzu)により内部配列解析をすすめたところ,数残基のアミノ酸配列が明らかになった。ホモロジー検索の結果,シアノバクテリアのアラニンラセマーゼの配列と類似していた。

This year, Thalassira gravida materials were tested and analyzed. , Toyopearl Butyl-650M (Tosoh) The chemical properties of these purified enzymes were adjusted to pH 9.0, D-and L-Ala specific substrates, and new additions to PLP enzyme inhibitors were necessary for activity development, and PLP enzyme inhibitors were similar in properties. The molecular weight of the protein is approximately 38 kDa, and the molecular weight is approximately 2 kDa. The physico-chemical properties of these compounds are very similar, and the activity of these compounds is very different from that of other compounds. The result of N-terminal alignment analysis is that the enzyme is refined, and the N-terminal alignment analysis is carried out. (Butyl(Wako) After digestion, reverse phase (ODS-120 T: Tosoh), the first step in the process of selecting the residue, the second step in the process of selecting the residue, the third step in the process of selecting the residue, and the fourth step in the process of selecting the residue. As a result of the search, the search engine is configured to perform the search.

项目成果

Hiroko Sakamoto: "Biological activity of the polysaccharide produced by the marine phytoplankton Porphyridium sp. and additive effect of slag on the polysaccharide production"Tetsu-to-Hagane. 89. 475-481 (2003)

Hiroko Sakamoto：“海洋浮游植物紫球藻产生的多糖的生物活性以及矿渣对多糖产生的附加作用”Tetsu-to-Hagane。