ハイマンノース型糖鎖結合ビーズを用いた細胞内レクチン様蛋白質の網羅的解析

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粗面小胞体においてハイマンノース型糖鎖を認識する細胞内レクチン様蛋白質がタンパク質の輸送、分解、フォールディング等の品質管理を担っていることが報告されている。申請者はこれらレクチン様蛋白質を網羅的に取得する方法として、化学合成によって得られる構造が均一なハイマンノース型糖鎖をビーズに結合させたハイマンノース型糖鎖結合ビーズを考案し、これを実現すべく本課題を申請した。15年度に確立した糖鎖合成法によりハイマンノース型糖鎖10糖(Man_8GN_2)、11糖(Man_9GN_2)、12糖(Glc_1Man_9GN_2)の大量合成(10mg~100mg)を行い、それらの糖鎖を用いて糖鎖ビーズの作成を行った。糖鎖ビーズと市販のConAや大腸菌によって大量発現した均一なCRT, Fbs1などのレクチン様タンパク質との結合実験を行ったところ、糖鎖構造依存的に結合することが明らかとなった。これらの情報をもとに生体試料からの細胞内レクチン様タンパク質の取得を行った。1.CRTを大量発現させた大腸菌菌体からのCRTの取得:菌体破砕液の可溶性画分中に糖鎖ビーズを縣濁、洗浄後、2Mグアニジンにて溶出したところCRTが選択的に回収された。以上のように細胞破砕液からもアフィニティー精製が可能であることを確認した。2.Aspergillus oryzaeのマイクロソーム画分の解析:A.oryzaeは大量のタンパク質を分泌する。従ってタンパク質品質管理系が発達しているのではないかと考え、糖鎖ビーズによる解析を試みた。その結果、G1M9ビーズに特異的に結合するタンパク質を取得した。PMF解析の結果、calnexin(CRTのパラログ)であると同定した。