歯周病関連菌のフォンヴィレブランド因子typeAドメイン類似蛋白質の機能解析

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歯周病関連菌であるPorphyromonas gingivalis(以下P.gingivalis)の染色体中にヒトの血中にある蛋白質の一つで、血小板凝固反応に必須なフォンウィレブラウン因子のタイプAドメイン(vWFA)に予測構造が相似な、von Willebrand Factor Type A domain protein (PgvWFA)と名付けられた遺伝子のmRNAが発現していること昨年確認した。本年度はこのPgvWFAの発現蛋白質の確認と局在を調べる為、PgvWFAの破壊株を作成した。P.gingivalis ATCC 33277(33277株)のPgvWFA遺伝子の5'末端部位にエリスロマイシン耐性遺伝子を相同組み換えにより挿入し、PgvWFAの欠損株を作成した。PgvWFAの欠損はサザンハイブリダイゼーチョンとRT-PCRにて確認した。またPgvWFAのvWFA領域の遺伝子断片をpGEXベクターに挿入し、大腸菌に形質転換しGST-vWFA融合蛋白質を発現、精製した。GST-vWFA融合蛋白質をFCAと混和後ウサギに免疫した。追加免疫後、採血して抗PgvWFA血清を得た。33277株とPgvWFA欠損株の細胞破砕液をSDS-PAGEに展開し、抗PgvWFA血清にてimmunoblottをおこなった。Whole cell lysate, membrane,分泌画分とも調べたが、結果は抗PgvWFA血清に反応するPgvWFA欠損株で欠落する特異的な蛋白質を検出する事は出来なかった。W83株ではPgvWFA遺伝子の隣にはvWFAへ領域を欠落したPgvWFA類似遺伝子が存在する。が、現在進行中の33277株のゲノム解析の結果ではPgvWFAの遺伝子は99%保存されているが、PgvWFA類似遺伝子は欠落している。この事からvWFA領域を保持することはP.gingivalisにとって意義があり、本年の研究で作製した変異株は今後のPgvWFAの研究に大いに役立つと考えられる。