時間分解紫外共鳴ラマン分光法によるガスセンサーヘム蛋白の情報検出・伝達の構造化学的研究

使用时间分辨紫外共振拉曼光谱对气敏血红素蛋白信息检测和传输的结构化学研究

基本信息

批准号：
04F04382
负责人：
北川禎三
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

O_2、CO、NO等の気体分子を検出してそれを機能部位に伝達し生理機能を発揮する事は、生物が環境に即応して生きていくうえで非常に重要な事であるが、蛋白質による情報検出及び伝達の分子機構はよく分からず、現在のトップテーマとなっている。本研究では、それを紫外共鳴ラマン法で蛋白質の分子振動を観測して解明する事を目的とする。材料としては、大腸菌にあってO_2センサーとして働くDos蛋白を取り上げた。そのセンサードメインの遺伝子を東北大多元研の清水透教授からいただき、それを大腸菌で発現させた。培養した大腸菌よりDos蛋白を単離・精製する方法を東北大学に出向いて習い受け、一人で全実験をできるようになった。精製したDos蛋白の酸化形、還元形、CO結合形の244及び229nmの励起の共鳴ラマンスペクトルを高いシグナル/ノイズ比で得る事に成功した。トリプトファンとチロシンのラマンバンドが観測された。センサードメインには53番と110番に2つのトリプトファンがあり、53番をフェニルアラニンに置換したW53F及び110番をイソロイシンに置換したW110Iミュータントを部位特異的アミノ酸置換法で遺伝子工学的につくり出した。酸化形と還元形のネイティブ分子の差スペクトルは、W110Iでは再現されたがW53Fでは再現されず、差ピークは無かった。この事はヘム鉄の酸化により53番トリプトファンが構造変化を示す事が明らかとなった。今回はDos蛋白のセンサードメインのみを調べたが、次のステップでは全長のDos蛋白質を発現させ、それに同種の実験でヘム鉄の酸化還元による蛋白部分の構造変化を紫外共鳴ラマン法で調べていく予定である。実験は順調に進み、2報の論文を書き終わっている。

检测诸如O_2，CO和NO之类的气体分子并将其传输到功能部位以发挥其生理功能，对于活生物体而言，在对环境的反应中生活非常重要，但是蛋白质的信息检测和传播的分子机制却尚不广泛，目前是最重要的主题。这项研究旨在通过使用紫外线共振拉曼法观察蛋白质的分子振动来阐明这一点。作为一种材料，我们采用了DOS蛋白，该蛋白在大肠杆菌中，充当O_2传感器。传感器领域的基因是从Tohoku大学贸易研究所的Shimizu Toru教授那里获得的，并在大肠杆菌中表达。我去了Tohoku大学学习如何将DOS蛋白与培养的大肠杆菌隔离，并能够自己进行所有实验。我们已经成功地获得了高信号/噪声比时在244和229 nm激发时在244和229 nm激发时氧化，还原和共键形式的共振拉曼光谱。观察到色氨酸和酪氨酸的拉曼带。传感器结构域在53和110中包含两个色氨酸，W53F带有苯丙氨酸，W110i突变体具有110，具有异亮氨酸的110突变体是使用位点特异性氨基酸替代方法进行了基因设计的。氧化和还原形式的天然分子之间的差异光谱在W110i中重现，但在W53F中没有复制，并且没有差异峰。这已经表明，由于血红素铁的氧化，色氨酸53号表现出结构性变化。这次，我们仅研究了DOS蛋白的传感器结构域，但是在下一步中，我们将表达全长DOS蛋白，在同一实验中，我们将使用紫外线resonance Raman方法研究蛋白质部分的结构变化。实验进行得很顺利，我写了两篇论文。