3次元再構築法を用いた根粒形成遺伝子の立体的発現解析

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熱帯地方のパイオニアプラントとして用いられているモルッカネムの根粒からmRNAを精製し、cDNAライブラリを作成した。約1000個のクローンの中からインサートが十分の長さ挿入されている100個のクローンについてシークエンス解析を行ったところ70遺伝子の単離に成功した。成熟根粒で過剰に発現していると考えられるレグヘモグロビンは100クローン中8クローンを占め、今回のライブラリが正確であることが確認できた。単離した70の候補遺伝子についてRT-PCR法を用いて根粒特異的に発現する8遺伝子に絞り込んだ。8遺伝子についてはRACE法を用いて全長を単離し、BLASTN, BLASTXによる相同性検索を行ったところ、ノジュリン遺伝子として知られるレグヘモグロビン、enod12,enod40,MtN21遺伝子との相同性が確認できた。ノジュリン遺伝子の他にもproline-rich protein、セリンカルボキシペプチダーゼ、2種類のunknown proteinが含まれており、根粒形成には今までに単離されていない遺伝子の関与が示唆された。これらの遺伝子を用いてin situ hybridization法で根粒内の組織特異性を調べたところ、すべて遺伝子が根粒内の特異的な組織で働いていることを確認した。さらにすべての切片のin situ hybridizationの情報をPCに取り込み、3次元再構築法を用いて立体的に遺伝子の発現を見ることに成功した(投稿準備中)。組織特異的な発現観察が立体的に出来るようになり、今後1つの遺伝子解析のツールとして使えると考えている。