ショウジョウバエを用いた小分子RNAによる遺伝子発現制御機構の解析

申請者は、機能性小分子RNAであるmiRNAがどのような分子機構で遺伝子発現の制御を行っているかに興味を持ち、miRNA成熟過程の詳細な機能解析を行った。前年度では、Dicer-1のパートナー分子としてLoqsを同定しその機能について報告するとともに、miRNA成熟過程におけるATP要求性についての新規知見を得たため、そのさらなる解析を進めてきた。本年度は、1)Loqsの機能解析に用いた方法を論文として報告し、2)miRNA成熟過程におけるATP要求性の解析を引き続き行った。以下にそれぞれの詳細を示す。1)in vitroにおけるpre-miRNAプロセッシング法:miRNAプロセッシングを解析するための、前駆体miRNA(pre-miRNA)を調製する方法と、細胞質抽出液および免疫沈降産物を用いたアッセイ法についての詳細を報告した(Methods Mol.Biol.)。2)miRNA成熟過程におけるATP依存的unwinding/loading因子の解析:ショウジョウバエmiRNA経路においては、miRNA/miRNA^*の一本鎖化(unwinding)および一本鎖となったmiRNAのArgonaute蛋白質への受け渡し(loading)にATPが必要とされる。このmiRNA unwinding/loadingのin vitroにおける再構築を既知因子であるDicer-1、Loqs、AGO1のリコンビナント蛋白質で行ったが、活性は検出されなかった。免疫沈降物を用いた場合も同様であった。これらのことから、unwinding/loadingは未知の因子によって行われており、この因子は免疫沈降等の相互作用を用いた方法では同定できないと考え、現在、液体高速クロマトグラフィーによってその因子の同定を進めている。この因子を同定することにより、今まで詳細が不明であったmiRNAのunwinding/loading分子機構が明らかになることが期待される。

申請者は、機能性小分子RNAであるmiRNAがどのような分子機構で遺伝子発現の制御を行っているかに興味を持ち、miRNA成熟過程の詳細な機能解析を行った。前年度では、Dicer-1のパートナー分子としてLoqsを同定しその機能について報告するとともに、miRNA成熟過程におけるATP要求性についての新規知見を得たため、そのさらなる解析を進めてきた。本年度は、1)Loqsの機能解析に用いた方法を論文として報告し、2)miRNA成熟過程におけるATP要求性の解析を引き続き行った。以下にそれぞれの詳細を示す。1)in vitroにおけるpre-miRNAプロセッシング法:miRNAプロセッシングを解析するための、前駆体miRNA(pre-miRNA)を調製する方法と、細胞質抽出液および免疫沈降産物を用いたアッセイ法についての詳細を報告した(Methods Mol.Biol.)。2)miRNA成熟過程におけるATP依存的unwinding/loading因子の解析:ショウジョウバエmiRNA経路においては、miRNA/miRNA^*の一本鎖化(unwinding)および一本鎖となったmiRNAのArgonaute蛋白質への受け渡し(loading)にATPが必要とされる。このmiRNA unwinding/loadingのin vitroにおける再構築を既知因子であるDicer-1、Loqs、AGO1のリコンビナント蛋白質で行ったが、活性は検出されなかった。免疫沈降物を用いた場合も同様であった。これらのことから、unwinding/loadingは未知の因子によって行われており、この因子は免疫沈降等の相互作用を用いた方法では同定できないと考え、現在、液体高速クロマトグラフィーによってその因子の同定を進めている。この因子を同定することにより、今まで詳細が不明であったmiRNAのunwinding/loading分子機構が明らかになることが期待される。