ラン色細菌の水素生産性向上に向けたニトロゲナーゼの改良

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窒素固定酵素ニトロゲナーゼ(N_2ase)は、窒素固定反応に付随して必然的に水素を発生する(N_2+8e^-+8H^++16ATP→2NH_3+H_2+16ADP+6Pi)。窒素固定するラン色細菌のN_2aseと光合成反応を利用して、水素を光生物的に生産することを目指し、水素生産性向上に向けた遺伝子工学的改良を行った。これまでに、Nostoc sp. PCC7120株で水素再吸収を抑制したヒドロゲナーゼ(H_2ase)遺伝子破壊株ΔhupL、ΔhupL/ΔhoxH株を作製し、水素生産活性が野性株の約4-7倍増大するという成果を得た。しかし、高活性時期が10時間程度しか持続しないという問題があったため、活性持続性の改善を目的として、N_2ase活性中心配位子ホモクエン酸の役割に着目し遺伝子改変を行った。ホモクエン酸はN_2ase活性中心FeMo-cofactorに配位し、従属栄養細菌Klebsiellaでは、ホモクエン酸合成酵素遺伝子nifVを破壊するとN_2aseの窒素固定活性は大幅に低下するが、水素生産性が増大する。N_2aseの窒素固定能が相対的に低下すれば、成長のための窒素栄養の要求性がより長く持続し、結果的に、N_2aseによる水素生産の高活性が持続するようになると期待されるNostoc sp. PCC7120株は、2つのnifV遺伝子(nifV1、nifV2)を持つ。野生株とΔhupL株を親株として、その一方または両方の遺伝子を破壊した6種の変異株を作製したところ、いずれの破壊株も窒素固定能は低下し、ヘテロシスト出現頻度も親株よりも高い頻度がより長く持続していた。ΔhupL/ΔnifV1株では、水素生産の高活性が親株ΔhupL株と比べてより長く持続し、カルチャー当たりの水素生産性が窒素飢餓培地移行後5日目まで増加し続け、N_2ガス気相下で親株よりも約2倍増大した。ノーザンブロットとgfpレポーターを利用した遺伝子発現解析から、nifV1遺伝子は窒素飢餓条件下でN_2aseが局在するヘテロシスト内で特異的に発現が誘導され、一方、nifV2遺伝子は窒素化合物存在下でも発現しており、窒素飢餓条件下で発現量が低下した。このことから、nifV1遺伝子破壊株では、ヘテロシスト内のホモクエン酸濃度が低下している可能性が考えられた。