マウス胃液及び胃粘膜上皮細胞におけるニトロソ化たん白質の網羅的解析

小鼠胃液和胃粘膜上皮细胞亚硝化蛋白的综合分析

• 批准号: 16790391
• 负责人: 大竹 一男
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Josai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790391/
• 关键词: 胃粘膜; ニトロソ化たん白質; 一酸化窒素; 硝酸塩; 亜硝酸塩; プロテオーム; ニトロソ化たんぱく質

一酸化窒素(NO)は、L-アルギニンからNO合成酵素(NOS)によって内因的に産生されるが、もう一つの経路として、野菜などに多量に含まれる硝酸塩や亜硝酸塩の摂取によって、外因的に胃内での酸性、還元的環境下で化学的にNOに変換され胃もしくは全身に供給される。胃におけるNOは、感染防御や局所血流の維持だけでなく、胃酸分泌、粘液分泌、重炭酸イオン分泌の制御等、胃の多彩な生理作用に非常に重要な役割を果たすことが知られている。加えて、NOは全身循環血液中において血管拡張作用、血小板凝集抑制作用、抗アテローム性動脈硬化など血液循環動態の本質的役割を果たしていることも知られている。近年、シグナリング分子としてのNOの役割に関心が注がれてきている。特にカスパーゼ系酵素やある種のイオンチャネル、リアノジンレセプターなどの機能性たん白質は、その構造中のスルフホドリル基(-SH基)がNO関連物質(N_2O_3やニトロソニウムイオン)によってS-ニトロソ化(-SNO)され、その機能が変化すること、更に、たん白質のS-ニトロソ化反応は、翻訳後修飾の代表であるリン酸化反応と連動・拮抗しながら生体の恒常性の維持を担うことも推察されてきている。そこで本研究では、上述した胃の様々な生理機能と上皮細胞におけるニトロソ化たん白質との関連性を評価するためのデータベースを構築するために(1)胃でのニトロソ化たん白質の検出(2)外因的NO供給源として亜硝酸塩をマウスに投与したときの胃粘膜ニトロソ化たん白質の質的、量的変化(3)胃粘膜ニトロソ化たん白質の分離並びにプロテオーム解析を行った。その結果、(1)瞬間凍結剥離法によってマウス胃粘膜と筋層を分離し、胃粘膜ニトロソ化たん白質の検出を、Jaffreyら(Nat Cell Biol.3:193-7,2001)の報告したビオチンスイッチアッセイ(若干変更)にて検出できた。(2)本法を用いて、マウスに亜硝酸塩を経口投与させた後の胃粘膜ニトロソ化たん白質をウエスタンブロッティング法にて定量的に評価すると、亜硝酸塩の投与量に依存して180,80,38,32,4kDaの分子量のニトロソ化たん白質が顕著に増加することを示した。加えて、これら分子量以外のたん白質も亜硝酸塩の摂取量に依存してニトロソ化されることも示した。(3)これらニトロソ化たん白質を網羅的に同定するために、胃粘膜ライセートにNOドナーであるニトロソグルタチオン(GSNO)を加え、可能な限りニトロソ化した後、ビオチンスイッチアッセイにてニトロソ化たん白質を標識し、ストレプトアビジンゲルカラムにて精製した後、二次元電気泳動にて、ニトロソ化たん白質を分離した。その結果、GSNOを加えていないサンプルよりもGSNOを加えたサンプル方が、顕著に30以上のニトロソ化たん白質が銀染色法によって検出された。ゲルスポットを切り出し、脱色後、トリプシンにて酵素消化し、脱塩したサンプルをMALDI-TOF MASSにてフィンガーマスプリンティングを行った結果、現在までのところ、比較的量の多いハウスキーピングたん白質のみが同定できた。今後は、検出された全てのニトロソ化たん白質の同定を行うことが残されている。

A nitric acid synthase (NOS), L-arbutin, and NO synthase (NOS) are produced by internal factors, such as nitric acid, nitric acid. NO, infection defense, blood flow maintenance, gastric acid secretion, mucus secretion, heavy carbon acid secretion control, stomach colorful physiological function is very important, the effect of cutting is very important. NO plays an important role in vasodilation, platelet aggregation inhibition, and anti-atherosclerosis. In recent years, the molecular structure of NO has been changed. In particular, it is a functional straight line of enzymes, a functional straight line of enzymes, a functional straight line of enzymes,(N_2O_3)~(-SNO)~(-SNO-)~(-(-SNO-)~(-(-SNO-)~(-SNO-)~(-(-SNO-)~(-(-)~(-SNO-)~(-SNO-)~ In this study, we evaluated the relationship between the physiological function of stomach and epithelial cells, and the relationship between gastric mucosa and epithelial cells.(3) The gastric mucosa is divided into two parts: one part is divided into two parts: the other part is divided into three parts: The results are as follows: (1) Instant Freezing and Peeling Method for Separation of Gastric Mucosa and Muscle Layer, Detection of Straight Line of Gastric Mucosa, Report of Jaffrey (Nat Cell Biol.3:193- 7, 2001) on Detection of Gastric Mucosa and Muscle Layer (Several Changes). (2)This method was used to evaluate the quantitative relationship between nitric acid and the amount of nitric acid administered and the increase of molecular weight of 180,80,38,32, 4 kDa. The amount of nitric acid depends on the molecular weight of the product. (3)In addition, the gastric mucosa may be restricted to the identification, refinement, and separation of the two-dimensional electrokinetic and electrokinetic straight lines. The results of GSNO are as follows: GSNO is added to the solution, and the solution is added to the silver stain. The results of MALDI-TOF MASS are as follows: In the future, we will continue to improve the quality of our products.