メタン発酵微生物共生系における微生物間相互作用の分子遺伝学的解析

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1.単独培養、共培養条件下での・H株のプロテオミクス▽共培養条件下の・H株の性状解析▲共培養条件下特異的発現タンパク質群の同定・発現量およびmRNA発現の解析異なる共生基質・水素発生型共生菌との共培養系を確立し、それら共培養系においてΔH株の遺伝子発現を2次元電気泳動およびメタン合成遺伝子群のmRNA発現を定量PCRで解析した。その結果、いかなる共生状態においても特異的に高発現する遺伝子を見出した。2.・H株の遺伝子操作系の構築▽ベクターの開発▲マーカーの選択(カナマイシン、ピューロマイシン、プリン体アナログ等)ピューロマイシン、カナマイシンがマーカーとして最適であることを見出し、ΔH株の至適生育温度に適した耐性遺伝子マーカーをもつプラスミドの構築を試みた。カナマイシンの耐熱耐性遺伝子をもつ遺伝子破壊プラスミドの構築を行った。Thermus thermophilusを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の耐熱化を試みた。その結果、ピューロマイシン耐性遺伝子の耐熱化は困難であり、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子を用いた遺伝子破壊プラスミドを実験に用いることにした。▽形質転換系の確立▲遺伝子導入法の確立リボソーム媒介法による上記遺伝子破壊プラスミドの形質転換を試みた。リボソームの検討、ΔH株プロトプラスト細胞との融合時間、リボソームとDNA量比等種々の条件検討を行った。▽・H株の寒天平板培地での簡易コロニー形成法の開発▲共培養パートナーの選択(従属栄養性高温性好気性(通性嫌気性)細菌)▲共培養条件の確立ΔH株の簡易平板培養法を構築した。本手法は様々な硫酸還元菌、メタン生成菌、水素発生型共生菌といった絶対嫌気性際微生物の培養に適用可能であることを明らかとし、その成果を,日本微生物生態学会、国際微生物生態学会で発表した。