糖質加水分解酵素を用いた担子菌細胞壁β-グルカンの構造変換とその生理機能解析

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担子菌細胞壁の主成分であるβ-1,3/1,6-グルカンは、多様な生物に対して生理活性があるといわれている。一方で菌体壁β-グルカンの構造は菌種だけでなく菌の生育環境によっても変化し、その結果これらの担子菌細胞壁から得られるβ-グルカンの重合度や分岐度等の多様性は、ほかの生物の生理活性に大きな影響を与えると考えられている。そこで平成18年度においては、全ゲノム配列が解読されている木材腐朽担子菌Phanerochaete chrysosporiumを用いて、担子菌β-1,3-グルカンの分解および構造変換を担っていると考えられる糖質加水分解酵素(Glycoside hydrolase; GH)の結晶構造を解析することを目的とした。Lam16Aの結晶構造解析Lam16Aは、エンド型の加水分解活性を有し、β-1,3-グルカンやラミナリオリゴ糖だけでなく、分岐構造を持つβ-1,3/1,6-グルカンに対しても高い加水分解活性を示す(平成17年度成果)。本研究においては、Lam16A変異体を構築し、酵素-糖質複合体における結晶構造の解析を行った。ラミナリオリゴ糖との複合体の構造解析を行った結果、本酵素は少なくとも7残基のグルコースを認識していた。また、酵素と複合体を形成している基質はヘリックス構造をとっていたことから、本酵素はβ-1,3-グルカンのヘリックス構造に即した活性中心を有していることが明らかとなった。更に、β-1,6-グルコシド結合を有する生成物との複合体の構造解析を行った結果、分岐構造であるβ-1,6-グルコシド結合は本酵素の活性中心において非常に強く認識されていることが明らかとなった。以上の結果より、本酵素は、β-1,3-グルカンよりもβ-1,6-グルコシド結合を有する分岐多糖であるβ-1,3/1,6-グルカンを加水分解するのに最も適した活性中心を有している酵素である可能性が強く示唆された。新規GHのスクリーニングおよびPichia pastorisによる大量発見これまで担子菌由来のβ-ロ1,3-グルカナーゼは、GHファミリー3、16、55などに属しているものが多く知られているが、P. chrysosporiumのゲノム配列をスクリーニングした結果、β-1,3-グルカンに対して高い糖転移活性があると推定される酵素がGHファミリー17に2種、GHファミリー72に1種新たに見いだされた。そこで、本研究においては、酵母菌P.pastorisを用いてこれらの酵素の大量発現系の構築を行った。