未分化胚性幹細胞における多分化能維持機構の解明

申請者は、未分化細胞におけるETnの転写制御機構を明らかにするため、5'LTR内の転写開始点より上流部分であるU3領域に着目してプロモーター活性を解析した。その結果、LTR内の5'CGGCGGGAATCCCCTCCCCCTTCCT-3'という領域が未分化細胞特異的なプロモーター活性化に重要であることを見出した。またサイズ分画により、この領域に結合し、未分化特異的にプロモーターを活性化する因子は75〜100kDaの画分から得られるということがわかった。これらの結果をもとに、ETnの転写活性化因子の候補を絞り込んだ。結合配列の後半部分はCとTが連続する非常に特徴的な配列を有している。このような配列に結合する因子としては、CTCF(CCCTC-binding factor)、およびCTCFのホモログであるBORIS(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)が知られている。BORISの発現ベクターを作成し、レポータージーンとともに、通常ETnプロモーター活性をもたないNIH 3T3細胞に導入したところ、BORIS発現ベクターとcotransfectionしたときのみ、ETnのプロモーター活性が上昇することが示された。BORISは11個のZinc Fingerを有しており、ZF領域を欠失させた発現ベクターをcotransfectionした場合にはレポーターの活性は全く上がらなかったことから、BORISがZinc Fingerを介してETnプロモーターを活性化させていると考えられた。さらに、CTCFの発現ベクターを導入した細胞でレポータージーンアッセイを行ったところ、BORIS発現ベクターを導入した場合と同様にETnの転写を活性化するということがわかったが、BORISとCTCFの発現ベクターを同時に導入した場合にさらに高い転写活性化能が見られることがわかった。また、タグ標識したBORISおよびCTCFを細胞に導入し免疫沈降を行った結果、両者はBORISのZn Fingerを介して相互作用するということがわかった。このことから、BORISとCTCFは協調してETnのプロモーター領域に結合し、転写活性化を担っている可能性が高いことが示された。

申請者は、未分化細胞におけるETnの転写制御機構を明らかにするため、5'LTR内の転写開始点より上流部分であるU3領域に着目してプロモーター活性を解析した。その結果、LTR内の5'CGGCGGGAATCCCCTCCCCCTTCCT-3'という領域が未分化細胞特異的なプロモーター活性化に重要であることを見出した。またサイズ分画により、この領域に結合し、未分化特異的にプロモーターを活性化する因子は75〜100kDaの画分から得られるということがわかった。これらの結果をもとに、ETnの転写活性化因子の候補を絞り込んだ。結合配列の後半部分はCとTが連続する非常に特徴的な配列を有している。このような配列に結合する因子としては、CTCF(CCCTC-binding factor)、およびCTCFのホモログであるBORIS(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)が知られている。BORISの発現ベクターを作成し、レポータージーンとともに、通常ETnプロモーター活性をもたないNIH 3T3細胞に導入したところ、BORIS発現ベクターとcotransfectionしたときのみ、ETnのプロモーター活性が上昇することが示された。BORISは11個のZinc Fingerを有しており、ZF領域を欠失させた発現ベクターをcotransfectionした場合にはレポーターの活性は全く上がらなかったことから、BORISがZinc Fingerを介してETnプロモーターを活性化させていると考えられた。さらに、CTCFの発現ベクターを導入した細胞でレポータージーンアッセイを行ったところ、BORIS発現ベクターを導入した場合と同様にETnの転写を活性化するということがわかったが、BORISとCTCFの発現ベクターを同時に導入した場合にさらに高い転写活性化能が見られることがわかった。また、タグ標識したBORISおよびCTCFを細胞に導入し免疫沈降を行った結果、両者はBORISのZn Fingerを介して相互作用するということがわかった。このことから、BORISとCTCFは協調してETnのプロモーター領域に結合し、転写活性化を担っている可能性が高いことが示された。