核の内膜タンパク質の小胞体から内膜への輸送機構の解明

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目的は、膜タンパク質の核の外膜から内膜への移動方法を明らかにする事にある。この目的を効果的に達成するために、生きた細胞内での膜タンパク質の移動の様子を観測する実験方法を構築した。これまでに、核の外膜-内膜移動方法として核膜孔の側でつながっている外膜と内膜の領域を通ってタンパク質が移動する方法が有力であることがわかっている。今年度、まず薬剤による輸送への影響を調べた。小胞体輸送、膜融合はカルシウムに依存している。そこで細胞内からカルシウムを除去するEGTA、BAPTAを加えたところ、輸送には影響しないことがわかった。つまり小胞体-ゴルジ体間の様な輸送とは異なる輸送機構があることが示唆された。更に、小胞体輸送、膜融合阻害剤として知られているNEMにおいても影響されなかった。またリン酸化に影響するstaurosporine、okadaicacidらの薬剤も膜タンパク質の核の内膜への移動を阻害しなかった。次に輸送に必要な細胞質の物質を明らかにするために新たな系を構築した。細胞に対してdigitonin処理を行い、核膜は正常なまま細胞膜のみ可溶化する。この状態の細胞を洗浄することで、細胞質画分を洗い流す。核膜、核の構造はそのままで、細胞質画分が洗い流された細胞に、別の細胞より抽出した細胞質を分画し、これを加え、輸送の様子を観察する。分画を進めることで輸送に必要な細胞質の物質を特定する。digitonin処理の条件を検討することにより、細胞膜が可溶化された細胞においても膜タンパク質の核の内膜への移動が観察された。この条件下で、核の構造が正常であることを証明するために、核移行シグナルを付加したBSA、NLS-BSA-Cy3を加えたところ、NLS-BSA-Cy3は核に蓄積した。この新たな系を用いることで、膜タンパク質の核の外膜から内膜への移動に必要な物質の同定が期待される。