ユビキチンリガーゼ変異株を利用した高感度真核生物Ames試験の開発のための研究

分裂酵母のSCFpof3はユビキチンリガーゼ複合体として機能する。その生理学的な標的タンパク質(SCFpof3によって分解されるタンパク質)はまだ未解明であるが、種々の解析結果より、ゲノムDNAの複製や安定な維持、適切な遺伝子発現の保障メカニズムに関与することがわかっている。SCFpof3遺伝子は生育そのものには必須ではないが、その遺伝子を破壊した分裂酵母はUV照射やDNA二重鎖切断の誘導剤phleomycin等に対し感受性を示す。我々はこれらDNAの損傷誘導剤に対し、マイルドな感受性を示す分裂酵母のSCFpof3変異体を利用した、高効率で簡便なDNA変異剤を試験・判定するアッセイ系の樹立を目指し、その準備段階のための基礎研究を行った。まずは、野生型の分裂酵母(WT)とSCFpof3遺伝子破壊株(Δpof3)とが示す、DNA損傷剤に対する感受性の比較をプレートアッセイ法ならびに、液体培地で培養した細胞を用いて行った。その結果、UVやPhleomycinに対しては野生型よりも3倍程度感受性が高いことがわかった。さらには、DNA合成阻害剤であるHUに対しても同程度の感受性を示すことがわかった。これらの感受性試験はプレート上に細胞濃度の異なるスポットを滴下し判定するプレートスポット法では結果の微妙な差異も容易に判定可能なことがわかったことから、本来の目的である未解析の化合物や、それらを含むものがプレートに混和可能な性状であれば容易に判定できる系であることを示す。さらには、スポットする際に一つのプレート(すなわち、一種類の化合物)に野生型、Δpof3に加えて異なる経路に働くRad変異株等も併用した場合、化合物の毒性判定の一助となり、より簡便で多様な系の開発もできることがわかった。

分裂酵母のSCFpof3はユビキチンリガーゼ複合体として機能する。その生理学的な標的タンパク質(SCFpof3によって分解されるタンパク質)はまだ未解明であるが、種々の解析結果より、ゲノムDNAの複製や安定な維持、適切な遺伝子発現の保障メカニズムに関与することがわかっている。SCFpof3遺伝子は生育そのものには必須ではないが、その遺伝子を破壊した分裂酵母はUV照射やDNA二重鎖切断の誘導剤phleomycin等に対し感受性を示す。我々はこれらDNAの損傷誘導剤に対し、マイルドな感受性を示す分裂酵母のSCFpof3変異体を利用した、高効率で簡便なDNA変異剤を試験・判定するアッセイ系の樹立を目指し、その準備段階のための基礎研究を行った。まずは、野生型の分裂酵母(WT)とSCFpof3遺伝子破壊株(Δpof3)とが示す、DNA損傷剤に対する感受性の比較をプレートアッセイ法ならびに、液体培地で培養した細胞を用いて行った。その結果、UVやPhleomycinに対しては野生型よりも3倍程度感受性が高いことがわかった。さらには、DNA合成阻害剤であるHUに対しても同程度の感受性を示すことがわかった。これらの感受性試験はプレート上に細胞濃度の異なるスポットを滴下し判定するプレートスポット法では結果の微妙な差異も容易に判定可能なことがわかったことから、本来の目的である未解析の化合物や、それらを含むものがプレートに混和可能な性状であれば容易に判定できる系であることを示す。さらには、スポットする際に一つのプレート(すなわち、一種類の化合物)に野生型、Δpof3に加えて異なる経路に働くRad変異株等も併用した場合、化合物の毒性判定の一助となり、より簡便で多様な系の開発もできることがわかった。