低リン血症性くる病マウスにおける象牙質形成異常とオステオカルシンとの関連

Phex遺伝子の欠失した、低リン血症性マウスに認められる象牙質形成異常と象牙芽細胞におけるオステオカルシンの発現量の増加がどのよう関連しているかを解明するため、以下の実験を行った。(1)オステオカルシン発現制御による石灰化への影響オステオカルシン遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をほ乳類発現ベクターに挿入し、これらのベクターを骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1細胞にトランスフェクションした。これらの遺伝子導入細胞がオステオカルシンの発現制御が行われているかをWestern Blot法にて確認し、オステオカルシン遺伝子の強発現細胞および発現抑制細胞を作製した。さらに、これらの細胞が骨芽細胞の特性を有していることを、骨芽細胞マーカーを用いたRT-PCR法にて確認した。これらの細胞を培養後、アリザリンレッド染色を行い、染色された石灰化ノジュールの面積を測定することから、遺伝子導入細胞の石灰化能を評価した。その結果、LucZ遺伝子をトランスフェクションしたコントロール細胞と比較して、オステオカルシン強発現細胞は石灰化能の低下が、また、オステオカルシン発現抑制細胞では石灰化能の亢進が認められた。(2)Phex遺伝子発現抑制によるオステオカルシン発現への影響Phex遺伝子のアンチセンス鎖あるいはコントロールとして用いたLucZ遺伝子を含むほ乳類発現ベクターを作製し、これらのベクターをMC3T3-E1細胞にトランスフェクションした。この細胞を培養後、total RNAを抽出し、定量的RT-PCR法を用いて、オステオカルシン遺伝子の発現量を比較した。その結果、Phex遺伝子を発現抑制した細胞はコントロール細胞と比較してオステオカルシン遺伝子の発現増加が認められた。これらの実験結果から、低リン血症性くる病マウスの象牙質石灰化異常はオステオカルシンの発現量の増加が関係していることが推察される。今後は、このマウスから分離した細胞にPhex遺伝子を強制発現させることよるPhex遺伝子のレスキューを行う予定である。

Phex遺伝子の欠失した、低リン血症性マウスに認められる象牙質形成異常と象牙芽細胞におけるオステオカルシンの発現量の増加がどのよう関連しているかを解明するため、以下の実験を行った。(1)オステオカルシン発現制御による石灰化への影響オステオカルシン遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をほ乳類発現ベクターに挿入し、これらのベクターを骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1細胞にトランスフェクションした。これらの遺伝子導入細胞がオステオカルシンの発現制御が行われているかをWestern Blot法にて確認し、オステオカルシン遺伝子の強発現細胞および発現抑制細胞を作製した。さらに、これらの細胞が骨芽細胞の特性を有していることを、骨芽細胞マーカーを用いたRT-PCR法にて確認した。これらの細胞を培養後、アリザリンレッド染色を行い、染色された石灰化ノジュールの面積を測定することから、遺伝子導入細胞の石灰化能を評価した。その結果、LucZ遺伝子をトランスフェクションしたコントロール細胞と比較して、オステオカルシン強発現細胞は石灰化能の低下が、また、オステオカルシン発現抑制細胞では石灰化能の亢進が認められた。(2)Phex遺伝子発現抑制によるオステオカルシン発現への影響Phex遺伝子のアンチセンス鎖あるいはコントロールとして用いたLucZ遺伝子を含むほ乳類発現ベクターを作製し、これらのベクターをMC3T3-E1細胞にトランスフェクションした。この細胞を培養後、total RNAを抽出し、定量的RT-PCR法を用いて、オステオカルシン遺伝子の発現量を比較した。その結果、Phex遺伝子を発現抑制した細胞はコントロール細胞と比較してオステオカルシン遺伝子の発現増加が認められた。これらの実験結果から、低リン血症性くる病マウスの象牙質石灰化異常はオステオカルシンの発現量の増加が関係していることが推察される。今後は、このマウスから分離した細胞にPhex遺伝子を強制発現させることよるPhex遺伝子のレスキューを行う予定である。