Gingipainによって切断される歯周病原性細菌病原因子の解析および同定

前年度は、gingipainによって切断されるCDl4依存性かつTLR2およびTLR4非依存性に自然免疫系を活性化する病原因子をP.gingivalis33277株由来gingipain完全欠損株(KDP136)より精製した。得られた精製標品をSDS-PAGEに展開し、認められたバンドをマススペクトロメトリーにより解析後、ATCC33277株のゲノム配列と照合すると、目的の病原因子はORF PGNU0748と同定された。本年度は、PGNU0748のリコンビナント蛋白(rPGNU0748)をHis tagを付与した発現ベクターにクローニングし、IPTGを添加して大腸菌で発現後、精製した。現在、全長および部分領域ごとのrPGNU0748を作成し、どの領域が7.19細胞(TLR2およびTLR4の両方の刺激伝達経路を欠くCHO細胞由来のNF-κBレポーター細胞)を活性化するのか検討している。更に、これらのrPGNU 0748を用いてポリクローナル抗体を作成し、どの領域に対するポリクローナル抗体が、rPGNU0748およびKDP136よる細胞の活性化を抑制するのか検討する予定である。また、33277株以外のP.gingivalis株におけるPGNU0748の存在様式をサザンプロッティング法で検討した。その結果、6株中3株に相似な遺伝子が認められ、PGNU0748の存在は、P.gingivalis菌株間で異なることが示された。

前年度は、gingipainによって切断されるCDl4依存性かつTLR2およびTLR4非依存性に自然免疫系を活性化する病原因子をP.gingivalis33277株由来gingipain完全欠損株(KDP136)より精製した。得られた精製標品をSDS-PAGEに展開し、認められたバンドをマススペクトロメトリーにより解析後、ATCC33277株のゲノム配列と照合すると、目的の病原因子はORF PGNU0748と同定された。本年度は、PGNU0748のリコンビナント蛋白(rPGNU0748)をHis tagを付与した発現ベクターにクローニングし、IPTGを添加して大腸菌で発現後、精製した。現在、全長および部分領域ごとのrPGNU0748を作成し、どの領域が7.19細胞(TLR2およびTLR4の両方の刺激伝達経路を欠くCHO細胞由来のNF-κBレポーター細胞)を活性化するのか検討している。更に、これらのrPGNU 0748を用いてポリクローナル抗体を作成し、どの領域に対するポリクローナル抗体が、rPGNU0748およびKDP136よる細胞の活性化を抑制するのか検討する予定である。また、33277株以外のP.gingivalis株におけるPGNU0748の存在様式をサザンプロッティング法で検討した。その結果、6株中3株に相似な遺伝子が認められ、PGNU0748の存在は、P.gingivalis菌株間で異なることが示された。