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ATP合成酵素のFoモーターの1分子回転観察-平面膜による膜電位の制御-

ATP合酶Fo马达的单分子旋转观察-平面膜对膜电位的控制-

基本信息

批准号：
06J08646
负责人：
上野博史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J08646/
关键词：
1分子計測分子モーター平面膜高速イメージング

项目摘要

本年度は、前年度に構築したエバネッセント照明による暗視野顕微鏡システム(以下、エバネッセント散乱法)の評価とこの手法を用いて回転分子モーターのサブミリ秒オーダーにわたる反応素過程の計測を行った。この手法との比較のために、対物レンズ内から垂直にサンプルを照明する手法(以下、垂直散乱法)を新たに構築して比較した。そのために、従来タイクロイックミラーを入れる場所に、中心に楕円のミラーコートがされた特殊なミラーを作製した。照明レーザー光はここで反射されて検出系とは反対側に垂直に照射されるので検出されない。一方、サンプルの散乱光はミラー部位以外の部分を通るので、背景光をカットした暗視野像が得られる。ガラスに固定した40nmの金コロイドを0.1ミリ秒の露光時間で、両手法により画像を取得したところ、エバネッセント散乱法は垂直散乱法と比べサンプル以外のバックグラウンド値が低く均一な画像が得られた。両者の画像のSN比を比べたところ、エバネッセント散乱法で得られた画像は垂直散乱法の画像と比べて約2倍のSN比を示した。さらに、金コロイドの重心の標準偏差からそれぞれの位置決定精度を測定したところ、両手法ともに約1〜2nmの位置決定精度を示した。さらに両手法は最高9.1マイクロ秒の露光時間においても約1〜2nmの位置決定精度を示した。マイクロ秒の時間分解能でナノメータの位置決定精度をもつこの手法はミリ秒以下のタンパク質のダイナミクスを計測するのに非常に有用であるといえる。さらにエバネッセント散乱法により、重水素置換が回転分子モーターであるF1のATP加水分解反応の素過程に与える影響を調べたところ、サブミリ秒単位の素過程の計測に成功し、重水素置換がATPのγリン酸の切断反応に影響を与えることを明らかにした。この結果から、F1のATP加水分解はプロトンの移動が律速であることが示唆された。

This year, compared with the previous year, the construction of dark field micro-mirror system (hereinafter referred to as "dark field micro-mirror system") has been evaluated. The method of vertical scattering is compared with the method of vertical scattering. All right, all right. The illumination light is reflected from the opposite side of the vertical illumination system. The scattered light in the background is not visible except in the dark field. For example, if the color is fixed to 40nm, the exposure time is 0.1 seconds, the image is obtained by the method of scattering, the vertical scattering method is obtained by the method of scattering, and the image is obtained by the method of scattering. The SN ratio of the portrait is about 2 times higher than that of the vertical scattering method. The standard deviation of the center of gravity of the gold rod is measured at a precision of about 1 ~ 2 nm. The maximum exposure time of 9.1 seconds is about 1 ~ 2 nm, and the position determination accuracy is shown. The time resolution of the second can be used to determine the accuracy of the position. The method is very useful for measuring the quality of the second. The calculation of ATP hydrolysis reaction process by heavy hydrogen replacement and ATP γ-acid cleavage reaction was successfully carried out. As a result, the ATP hydrolysis of F1 is not stable.