顕微鏡視野内におけるDNA複製反応の1分子直接観察と形態制御技術の開発

DNA合成および複製反応の1分子観察を目的として研究を進めた。1分子観察法は、従来行われてきた電気泳動などによる解析では平均値のなかに隠れてしまう個々の分子の挙動や集団の分布を明らかにできると期待されている手法である。DNA-タンパク質間相互作用では転写(RNA polymerase)、組換(RecA, RecBCD)に関与する因子の1分子動態解析が行われてきたが、DNA合成、DNA複製に関する1分子観察はほとんど行われていない。DNA合成、DNA複製反応の解析に1分子観察法を適用することで新たな知見を得ることが期待できる。本研究ではこれを実現するために(1)鋳型となる1本鎖DNA(ssDNA)を顕微鏡視野内で調製すること、(2)調製したssDNAを顕微鏡視野内で可視化および安定化させることについて重点的に研究した。(1)については蛍光顕微鏡視野内でexonucleaseIIIによる1分子DNA消化反応の可視化を行い、DNA合成の鋳型になりうる直鎖状ssDNAを顕微鏡視野内に調製できることを示した。またこの過程でDNAの形態がDNA消化反応に影響を及ぼしていることが1分子観察によって示された。このことは非常に興味深く、DNA合成などにも形態が関与している可能性が考えられる。(2)については真核細胞のssDNA結合タンパク質であるReplication Protein Aの蛍光標識技術を確立した。今後以上の成果を組み合わせることでDNA合成・DNA複製の可視化が可能になると考えられ、さらにDNAの形態がこれらの反応に寄与するかどうかも1分子観察により明らかにされると思われる。

DNA合成および複製反応の1分子観察を目的として研究を進めた。1分子観察法は、従来行われてきた電気泳動などによる解析では平均値のなかに隠れてしまう個々の分子の挙動や集団の分布を明らかにできると期待されている手法である。DNA-タンパク質間相互作用では転写(RNA polymerase)、組換(RecA, RecBCD)に関与する因子の1分子動態解析が行われてきたが、DNA合成、DNA複製に関する1分子観察はほとんど行われていない。DNA合成、DNA複製反応の解析に1分子観察法を適用することで新たな知見を得ることが期待できる。本研究ではこれを実現するために(1)鋳型となる1本鎖DNA(ssDNA)を顕微鏡視野内で調製すること、(2)調製したssDNAを顕微鏡視野内で可視化および安定化させることについて重点的に研究した。(1)については蛍光顕微鏡視野内でexonucleaseIIIによる1分子DNA消化反応の可視化を行い、DNA合成の鋳型になりうる直鎖状ssDNAを顕微鏡視野内に調製できることを示した。またこの過程でDNAの形態がDNA消化反応に影響を及ぼしていることが1分子観察によって示された。このことは非常に興味深く、DNA合成などにも形態が関与している可能性が考えられる。(2)については真核細胞のssDNA結合タンパク質であるReplication Protein Aの蛍光標識技術を確立した。今後以上の成果を組み合わせることでDNA合成・DNA複製の可視化が可能になると考えられ、さらにDNAの形態がこれらの反応に寄与するかどうかも1分子観察により明らかにされると思われる。