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真核及び原核生物由来スクアレン環化酵素の触媒機構の比較研究

真核与原核角鲨烯环化酶催化机制的比较研究

基本信息

批准号：
18380072
负责人：
星野力
金额：
$ 6.54万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

真核及び原核生物由来スクアレン環化酵素の触媒機構の比較研究のため、原核と真核生物由来の環化酵素の研究を別々に行った。(1)原核生物由来のスクアレン環化酵素(SHC)1.SHCの触媒機構としてカチオン/π-相互作用が指摘されていたが、実証されてなかった。非天然型アミノ酸をjn vivo(O-methylTyr)及びjn vitro(FluoroPhe)での導入法を確立した。速度論を行い、K_n, K_<cat>を求めた。FluoroPheの変異酵素では、Kmが変化せず、導入フッ素の数に従ってkcatが大きく低下した。また、cation-πbinding energyに従ってプロットすると良好な直線関係が得られた。この事実は、トリテルペンの環化反応ではカチオン/π-相互作用が重要な触媒機構として働いていることを明確に示している。本研究成果をJ.Am.Chem.Soc.128,13184-13194(2006).に発表した。2.2,3-スクアレンジオール及び2,3:22,23-ジオキシドスクアレンをSHCと酵素反応を行ったところ、エポキシダンマランが高収量で生成した。この事は、反応途中で6/6/6/5-fused tetracycleのカチオンが生成している事、かつSHCを使って天然物のone-pot合成が可能であることを実証した。Org.Biomol.Chem.5,792-801(2007)に発表した。(2)真核生物(イネ)由来のスクアレン環化酵素(OSC)ホモロジー検索から、6個の遺伝子が候補にあがった。それぞれの遺伝子をpYES2に連結し、OSC欠損株の酵母に形質転換した。培養した酵母の菌体から脂質成分を抽出して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、この道伝子がコードしている産物を単離した。現在2つの遺伝子産物の同定に成功した。

Comparative research on the catalytic mechanisms of eukaryotic and prokaryote-derived cycloenzymes, and differential research on prokaryotic and eukaryotic derived cycloenzymes were conducted. (1)Prokaryote Origin of Cyclase (SHC) 1. The Catalytic Mechanism of SHC and the π-interaction between SHC and SHC The introduction method of non-natural acid, vivo(O-methylTyr) and vitro(FluoroPhe) was established. K_n, K_<cat>n. FluoroPhe's enzymes are low, Km is low, Km is low. A good linear relationship is obtained between the energy and the binding energy. This is a clear indication of the importance of the catalytic mechanism of the cyclization reaction. J. Am. Chem. Soc. 128, 13184 -13194(2006). It's a sign. 2.2,3- The 6/6/6/5-fused tetracycle is a natural substance that can be synthesized in one pot. Org. Biomol. Chem. 5, 792 -801(2007). (2)Eukaryotic origin of the enzyme (OSC), six genes and candidate genes The yeast of the OSC deficient strain was transformed into a mutant strain. Culture of yeast cells, extraction of lipid components, separation of lipid components and separation of lipid components Now 2 pieces of genetic products are successfully identified.