ビタミンB12補酵素関与ジオールデヒドラターゼ再活性化因子の精密作用機構の解明

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本年度計画していたATP結合型ジオールデヒドラターゼ再活性化因子(DDR)、およびジオールデヒドラターゼ(DD)・DDR複合体のX線結晶構造解析のうち、DD・DDR複合体については結晶を得るに至らなかったが、ATP結合型DDR(DDに対する低親和性型)に関しては、ヌクレオチド非結合型DDRの結晶にATPの非加水分解性アナログであるATPγSをソーキングし、その結晶を用いてSpring-8にてデータ測定を行った。以前に報告したADP結合型DDR(DDに対する低親和性型)の構造を用いて分子置換法で構造決定を行い、3.3Åの分解能でATPγS結合型DDRの構造を明らかにした。今後さらなる条件の改良によって分解能を向上させ、ADP結合型DDRとの構造比較を行う。また、前年度に発現系を構築した、DD・DDR複合体の形成に重要であると考えられるアミノ酸残基に変異を導入した変異型DDRを発現・精製し、再活性化やDD・DDR複合体の形成に対する影響を解析する予定であったが、精製のためにDDRαサブユニットのN末端に付加したHisタグや変異導入の影響により、蛋白質の発現においていくつかの問題が発生した。今回発現系を構築した変異型DDRはα/βサブユニットの相互作用に関係するアミノ酸残基に変異を導入しており、蛋白質の安定性の問題から迅速に精製する必要があり、精製用のタグの導入は不可欠である。そこで発現系の改良を行い、DDRαサブユニットのC末端側にHisタグを付加したところ、タグを付加していない天然型DDRと同様の発現を示したので、このプラスミドに部位特異的変異を導入し、変異型DDRの発現系を構築した。本年度中に結果を得ることは出来なかったが、今後、精製した変異型DDRを用いて機能解析を行う予定である。これらの実験で得られる結果は再活性化の詳細な分子機構の解明につながることが期待される。