超好熱古細菌パイロコッカスを用いた真核生物型DNA複製分子装置の試験管内再構成

使用超嗜热古菌火球菌体外重建真核 DNA 复制分子装置

• 批准号: 18770154
• 负责人: 松永 藤彦
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770154/
• 关键词: 染色体; DNA 複製; Cdc6; ORC; MCM; 古細菌; ゲノム; DNA複製; 核酸; 蛋白質

古細菌におけるDNA複製開始反応のメカニズムを分子レベルで明らかにするため、DNA複製開始初期反応の試験管内再構成系を構築し解析した。超好熱古細菌パイロコッカスにおいて、DNA複製の開始起点(oriC)はCdc6/Orc1蛋白質が認識する。このとき染色体DNA上で起こる現象を解析した。まず、試験管内においてoricを持つプラスミドDNAと精製Cdc6/Orc1蛋白質を反応させた。その上で一本鎖DNA特異的なP1ヌクレアーゼを作用させるとoric内で切断箇所のある事が分かった。プライマー伸長反応によってその場所を特定した結果、Cdc6/Orc1蛋白質によってoriC内部に存在するアデニンおよびチミンに富む13bpの配列が特異的に二重鎖開裂を起こすと分かった。このDNA二重鎖開裂反応にはoriCプラスミドが負の超らせん構造を取っていることが重要であり、トポイソメラーゼによって超らせんを解消したプラスミドや直鎖状のプラスミドでは二重鎖開裂反応が起こらなかった。Cdc6/Orc1蛋白質がoriCに結合することでトポロジカルな変化が起こり、その結果DNA二重鎖開裂に至ることが分かった。次にCdc6/Orc1のATPase活性を解析した。Cdc6/Orc1がoriC内のORB配列に結合することでATPase活性がほぼ完全に抑制された。一方で、Cdc6/Orc1がヌクレオチドに結合すること、あるいは結合するヌクレオチドの種類が違うことでDNA二重鎖開裂反応の効率は大きく影響されないことが分かった。従って、ATPの加水分解を介した複製開始反応の制御は、DNA二重鎖が開裂した後のMcmヘリカーゼ導入の段階である可能性が示唆された。

DNA replication in archaea begins to reverse the formation of DNA molecules, and DNA replication begins to reverse the formation of DNA in vitro. Hyperthermophilic archaea are recognized as the origin of DNA replication (oriC) and Cdc6/Orc1 protein. Analysis of the phenomenon on chromosome DNA. In the presence of DNA and purified Cdc6/Orc1 protein in the tube, it is possible to detect the presence of Cdc6/Orc1 protein. The DNA of a single lock is specifically P1. As a result, the Cdc6/Orc1 protein has a unique double-lock cleavage mechanism within the Cdc6/Orc1 protein. The DNA double lock cleavage is very important because it is very difficult to get rid of the DNA double lock cleavage. Cdc6/Orc1 protein oriC binding is the result of DNA double lock cleavage. Analysis of Cdc6/Orc1 ATPase activity. Cdc6/Orc1 ORB alignment results in complete inhibition of ATPase activity. One side, Cdc6/Orc1, two side, two side The possibility of DNA double-locking is demonstrated by the possibility of DNA double-locking and DNA double-locking.

项目成果

DNA複製開始の分子機構:パイロコッカスから読み解く普遍性と多様性

DNA复制起始的分子机制：火球菌揭示的普遍性和多样性

• 发表时间: 2007
• 作者: Matsunaga;et. al.;松永藤彦
• 通讯作者: 松永藤彦

Genomewide and biochemical analyses of DNA-binding activity of Cdc6/Orc1 and Mcm proteins in Pyrococcus sp.

CDC6/ORC1和MCM蛋白的DNA结合活性的基因组和生化分析。

• DOI: 10.1093/nar/gkm212
• 发表时间: 2007
• 期刊: NUCLEIC ACIDS RESEARCH
• 影响因子: 14.9
• 作者: Matsunaga, Fujihiko;Glatigny, Annie;Mucchielli-Giorgi, Marie-Helene;Agier, Nicolas;Delacroix, Herve;Marisa, Laetitia;Durosay, Patrice;Ishino, Yoshizumi;Aggerbeck, Lawrence;Forterre, Patrick
• 通讯作者: Forterre, Patrick

The GINS Complex from Pyrococcus furiosus Stimulates the MCM Helicase Activity*

• DOI: 10.1074/jbc.m707654200
• 发表时间: 2008-01
• 期刊: Journal of Biological Chemistry
• 影响因子: 4.8
• 作者: Takehiro Yoshimochi;R. Fujikane;M. kawanami;F. Matsunaga;Y. Ishino