多機能リアーゼの高度機能特化とLードーパ生産の新展開

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チロシンフェノールリアーゼは,パーキンソン氏病の治療薬であるL-ドーパの合成を担う産業上重要な酵素である。本酵素の生理的役割はチロシンの分解であるため,その逆反応を利用するL-ドーパ合成には大きな困難が伴っており,その効率化が望まれている。そこで本研究は,「酵素の改変技術を,加水分解酵素や転移酵素のみならず,リアーゼにも適用する」という理念のもと,チロシンフェノールリアーゼ(TPL)を合目的に機能特化してL-ドーパ生産に結びつけるとともに,その反応機構の詳細を理解することを目的とした。合成反応に特化した変異型TPLのスクリーニング手法として,大腸菌のチロシン要求性株に変異型tpl遺伝子を導入し,フェノールを含む最少培地上で早く生育するものを選抜するという方法を開発した。得られる変異株中では,合成反応効率が高くなっていることが期待された。スクリーニングの結果得られた変異体中のtpl遺伝子を解析したところ,ORF内ではなくプロモーター部位に変異が集中していた。現在,変異型功tpl遺伝子を使用したL-ドーパ生産の効率化に取り組んでいる。また,ランダム変異を導入したプラスミドライブラリーを効率的に作製する目的で,新規な変異導入法を開発した。本法は,通常のエラープローンPCR法とは違い,(1)変異の蓄積がない,また(2)ライゲーションの必要がないという点で優れた手法である。現在,本手法を利用した変異体ライブラリーを作製して,再度スクリーニングを試みている。