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Nucleofectionによる神経栄養因子遺伝子導入骨髄細胞を用いた神経再生

通过核转染使用神经营养因子基因转移的骨髓细胞进行神经再生

基本信息

批准号：
18791034
负责人：
酒井義人
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18791034/
关键词：
骨髄間質細胞 Nucleofection 遺伝子導入神経再生

项目摘要

遺伝子導入法の一種であるNucleofection法を用いて、神経栄養因子の一つであるGlial cell derived neurotrophic factor(GDNF)を骨髄間質細胞へ遺伝子導入することに成功した。6週齢SDラット大腿骨から取り出した骨髄間質細胞を10日間培養し、mouse GDNF cDNA(pcDNA3.1/Zeo(+)-mGDNF)を大腸菌プラスミドに組み込み精製した。骨髄間質細胞10^6個に対し、5μgのGDNF cDNAをNucleofectorを用いプログラムA-23でNucleofectionを行なった。導入12時間後にELISAでGDNFの発現を評価した。コントロールで発現は見られず、GDNF導入骨髄間質細胞では1812.9pg/mlと、導入していない骨髄細胞の25.8倍の発現を認めた。また導入12時間後のRT-PCRでは、negative controlではmRNAの発現は認めず、GDNF導入骨髄細胞でmRNAの発現を認めた。抗GDNF抗体による免疫染色でもGDNF導入骨髄細胞で陽性細胞が多く認められ、非ウィルス的に多分化能を有する骨髄間質細胞に神経栄養因子を遺伝子導入可能である事が確認された。この研究結果を得た後に、6週齢SDラットを用い別の同種ラット大腿骨から採取した骨髄間質細胞に上記と全く同じ手法で遺伝子導入し、12時間後に15mmの脛骨神経欠損モデルにシリコンチューブを介して再生実験を行った。細胞はシリコンチューブ内に10^5個を移植し12週後に、骨髄間質細胞のみの移植、自家神経移植群と病理及び電気生理学的に再生を比較した。結果は遺伝子導入を行わない骨髄間質細胞のみの移植に比べ再生は劣っており、自家神経移植にも及ばなかった。骨髄間質細胞の神経再生に関与する機序として支持細胞として再生に寄与した可能性が高いと考えた。

One of the methods of gene transfer is Nucleofection. One of the methods of gene transfer is Glial cell derived neurotrophic factor(GDNF). 6-week-old femoral stromal cells were harvested and cultured for 10 days. Mouse GDNF cDNA(pcDNA3.1/Zeo(+)-mGDNF) was isolated from Escherichia coli and purified. 10^6 pairs of bone stromal cells, 5μg of GDNF cDNA for Nucleofection 12 hours after introduction, GDNF expression was evaluated. The expression of GDNF was 1812.9 pg/ml in bone marrow stromal cells and 25.8 fold in bone marrow cells. mRNA expression was detected by RT-PCR after 12 hours of GDNF introduction and negative control. Anti-GDNF antibody immunostaining confirmed that GDNF was introduced into bone marrow cells, and that there was a possibility of neurotrophic factor gene introduction into bone marrow stromal cells. The results of this study were obtained after 6 weeks of SD treatment, and 12 weeks after treatment, 15mm of tibial nerve defect was induced by the same method. 12 weeks after transplantation, bone marrow stromal cell transplantation, autologous neurotransplantation, and electrophysiological regeneration were compared. The results showed that the gene transfer process was better than that of the regeneration process, the transplantation process and the transplantation process. The mechanism of bone stromal cell regeneration is highly probable.