アシルCoA合成酵素の新機能の応用酵素学的解析

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本研究で対象とするPseudomonas chlororaphis B23菌は、ニトリルヒドラターゼ(NHase)によりニトリルを水和してアミドにし、さらにアミダーゼ(Amidase)により酸とアンモニアに分解する。本ニトリル遺伝子クラスター下流に存在するアシルCoA合成酵素遺伝子の産物(AcsA)は、脂肪酸とCoAのチオエステル結合形成を触媒してアシルCoAを合成する。本酵素において、CoAに代わるチオール基質については研究が行われていなかったが、CoAの代わりにL-cysteineやチオール含有アミノ酸誘導体等を用いた時に新たな反応産物ピークが検出された。これら新規反応産物の同定を行った結果、脂肪酸基質とL-Cysteineがアミド結合した化合物であることが判明した。即ち、アシルCoA合成酵素はCoA以外にもL-Cysteineを基質にすることができ、さらに、本来のチオエステル結合(-CO-S-)形成だけではなく、アミド結合(-CO-NH-)形成をも触媒することをこれまでに明らかにした。さらに、Saccharomyces cerevisiaeのアセチルCoA合成酵素を用い、酢酸とL-cysteine、ATPを加えて酵素反応を行った場合にも同様に新たな反応産物の生成が認められた。アシルCoA合成酵素はadenylate-forming superfamilyに属し、甲虫ルシフェラーゼも本、superfamilyに含まれる。そこで、ホタルルシフェラーゼを用い、ルシフェリンとL-cysteineを基質として本新規反応を検討した結果、反応産物の分離およびMS分析に成功し、本酵素においても新規反応産物の生成が確認された。以上のことから、本新規合成反応はP.chlororaphis B23のアシルCoA合成酵素やアシルCoA合成酵素ファミリーに限らず、adenylate-forming superfamilyに属する酵素が普遍的に持つ活性であると考えられる。次に、本新規反応における脂肪酸基質について基質特異性を調べた結果、数種の脂肪酸において産物であるN-Acyl-L-cysteineの生成が確認された。また、脂肪酸基質を固定し、L-Cysteine以外の化合物(L-Cysteine類似化合物・チオール化合物・アミン等)を用いた場合にも反応が進行するかどうかを調べた結果、新規の反応産物の生成が確認された。