エキノマイシン生合成遺伝子群を用いた非リボソーム依存型ペプチド合成酵素の機能解析

利用棘霉素生物合成基因对非核糖体依赖性肽合成酶进行功能分析

• 批准号: 07J01378
• 负责人: 纐纈 健人
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J01378/
• 关键词: 非リボソーム依存型ペプチド合成酵素; エキノマイシン; テトラヒドロイソキノリン; サフラマイシン; ピクテットーシュペングラー反応; 生合成; 酵素合成; エクテナサイジン; SF-1739HP; デヒドロ-L-アルギニン; SF-1739 HP; マクロラクトン化; 遺伝子クラスター; 酸化酵素; L-アルギニン

非リボソーム依存型ペプチド合成酵素(NRPS)は、エキノマイシン、サフラマイシンなど多様な構造を有する二次代謝産物の生合成を担う。前年度私は、サフラマイシンNRPSの一つ、SfmC(テトラドメイン、C-A-PCP-R)が単独で一挙に5環性テトラヒドロイソキノリン骨格を組み上げることを発見した。本年度は、SfmCの詳細な反応機構を調べるために、様々な基質アナログ、および、SfmCのドメイン欠損変異体を用いて反応解析を行った。1.アシル鎖の長さが異なる種々のAcyl-L-Ala-Gly-S-CoAを合成し、SfmC反応を調べた。炭素鎖16と14のアシル鎖を持つ基質では変換生成物が得られたが、炭素鎖12以下のアナログでは、収率が極端に低下した。2.反応効率向上を目指し、中間体Acyl-L-Ala-glycinalを化学合成し、これを用いて酵素反応を検討した。結果、CoAエステルを基質とした場合よりも、10倍以上反応効率が向上した。また、炭素鎖12のラウリル酸を結合したCoAエステルでは、反応生成物の収率は極めて低かったが、アルデヒド体Lauroyl-L-Ala-glycinalを用いると、炭素鎖が長いアナログと同程度の活性を示した。このことから、最初のチオエステルの還元反応において、アシル鎖の長さが特に重要な影響を与えることがわかった。3.Pictet-Spengler反応を触媒するドメインを特定するために、二種の変異体、C-A-PCP、もしくは、A-PCP-R tridomainを作成し、反応を解析した。得られた結果から、R-domainがチオエステルの還元を、C-domainがPictet-Spengler反応を触媒することを明らかにした。今回発見した知見は、NRPSの触媒機能の多才性を示すものであり、本研究分野において革新的な成果になると信じる。また、今回開発した手法は、化学-酵素ハイブリッドプロセスによる様々なサフラマイシンアナログの創出が可能であることを提示しており、酵素による有用物質(臨床用抗がん剤エクチナサイジンの前駆体など)の生産の可能性を大きく向上させると期待している。

NRPS is responsible for the production and synthesis of secondary metabolites due to the existence of multiple structures. In the previous year, the first batch of NRPS, SfmC(C-A-PCP-R) and SfmC(C-A-PCP-R) have been developed into a single batch of 5-ring C-A-PCP-R. This year, SfmC's detailed response mechanism was adjusted, and the matrix was analyzed. 1. Acyl-L-Ala-Gly-S-CoA synthesis and SfmC synthesis Carbon lock 16:14 and carbon lock 12:14 and carbon lock 16:14 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16:14 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16:14 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16:14 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16 and carbon lock 16:12 and carbon lock 12 and carbon lock 16:12 and carbon lock 16 and carbon lock 16 2. Chemical synthesis of the intermediate Acyl-L-Ala-glycine and the use of enzyme in the reaction are discussed. The result is that the ratio of reaction is higher than 10 times. In addition, the carbon chain 12 has been shown to be active in the presence of Lauroyl-L-Ala-glycine at a very low rate. This is the first time that we've had such an impact. 3. Pict-Spengler reaction catalyst is composed of two kinds of different materials, C-A-PCP, A-PCP-R tridomain and anti-catalyst. The result is that the R-domain is the same as the Pict-Spengler. This paper presents the results of this research on the diversity of NRPS catalytic functions. The possibility of production of useful substances (precursors of clinical anti-inflammatory drugs) by enzymes is expected to increase.

项目成果

Reconstruction of the saframycin core scaffold defines dual Pictet-Spengler mechanisms

• DOI: 10.1038/nchembio.365
• 发表时间: 2010-06-01
• 期刊: NATURE CHEMICAL BIOLOGY
• 影响因子: 14.8
• 作者: Koketsu, Kento;Watanabe, Kenji;Oikawa, Hideaki
• 通讯作者: Oikawa, Hideaki

テトラヒドロイソキノリン系抗生物質SF-1739 HP生合成遺伝子クラスターのクローニングと機能解析

四氢异喹啉抗生素SF-1739 HP生物合成基因簇的克隆及功能分析

• 发表时间: 2008
• 作者: 纐纈健人;大栗博毅;渡辺賢二;及川英秋;纐纈健人;纐纈健人;纐纈 健人
• 通讯作者: 纐纈 健人

Enzymatic macrolactonization in the presence of DNA leading to triostin A analogs

DNA 存在下的酶促大内酯化生成 triostin A 类似物

• 发表时间: 2008
• 期刊: Chem.Biol. Vol.15, No.1
• 作者: K.Koketsu;H.Oguri;K.Watanabe;Oikawa H.
• 通讯作者: Oikawa H.

テトラヒドロイソキノリン系抗腫瘍抗生物質SF-1739HP生合成経路の解明

阐明四氢异喹啉抗肿瘤抗生素SF-1739HP的生物合成途径

• 发表时间: 2009
• 作者: 纐纈健人;大栗博毅;渡辺賢二;及川英秋;纐纈健人;纐纈健人
• 通讯作者: 纐纈健人

Cloning and Characterization of the SF-1739 Biosynthetic gene cluster from Streptomyces griseoplanus SF-1739

灰扁平链霉菌 SF-1739 生物合成基因簇的克隆和表征

• 发表时间: 2008
• 作者: 纐纈健人;大栗博毅;渡辺賢二;及川英秋;纐纈健人;纐纈健人;纐纈 健人;纐纈健人
• 通讯作者: 纐纈健人