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蛍光消光現象を利用した新規遺伝子定量手法の開発及び食品検査への応用

利用荧光猝灭现象开发新的基因定量方法及其在食品检测中的应用

基本信息

批准号：
07J01906
负责人：
谷英典
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に,蛍光消光現象を利用することで,内部標準法で,かつ,遺伝子増幅後もしくは遺伝子増幅前後に蛍光を測定することで遺伝子の定量が可能なAlternately binding probe competitive-PCR(ABC-PCR)法の開発に成功している。本年度では,ABC法を新規遺伝子等温増幅法であるLoop-mediated isothermal amplification(LAMP)法に応用することで,より迅速かつ安価に定量が可能なABC-LAMP法の開発を行った。ABC-LAMP法の確立にあたり,モデルターゲットとして,Nitrosomonas europaeaのamoA遺伝子を用いて検討を行った。N.europaeaから抽出したゲノムDNAを用いて,ABC-LAMP法およびReal-time PCR法により,amoA遺伝子のコピー数を測定した結果,ABC-LAMP法はReal-time PCR法と同等の精度・再現性を持つことがわかった。さらに,遺伝子増幅阻害物質を添加し,ABC-LAMP法,およびReal-time PCR法における定量値への影響を評価した結果,Real-time PCR法では,遺伝子増幅阻害物質の濃度が増加するにつれ真値よりも低い値を示したが,ABC-LAMP法では,これらの濃度に依存せず真値に近い値を示した。以上より,ABC-LAMP法は正確かつ安価な遺伝子定量が可能であることが示された。次に,遺伝子組換えダイズの内在性配列Le1および組換えダイズ特異的配列RRSをターゲットとして,ABC-LAMP法を適用した結果,それぞれの遺伝子のLAMPプライマーの設計及び検量線の作成に成功した。さらに,本手法の原理を応用することで,C型肝炎ウイルスのヘリケース活性測定法及び白血病マーカー遺伝子の測定法の開発等にも成功した。

In the past year, light extinction phenomenon has been utilized, and the internal standard method has been successfully developed to determine the amount of light before and after the amplification of the gene. Alternately binding probe competitive-PCR(ABC-PCR) method has been successfully developed. This year, the ABC method was newly developed, and the Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) method was rapidly developed. ABC-LAMP method was established to detect the presence of Nitrosomonas europaea amoA gene. N.europaea DNA was extracted and analyzed by ABC-LAMP and Real-time PCR. The results showed that ABC-LAMP had the same accuracy and reproducibility as Real-time PCR. In addition,ABC-LAMP method, Real-time PCR method and Real-time PCR method were used to evaluate the quantitative value of the influence of additive on amplitude-increasing harmful substances. Real-time PCR method showed that the concentration of amplitude-increasing harmful substances increased. ABC-LAMP method showed that the concentration of amplitude-increasing harmful substances depended on the true value. ABC-LAMP method is not correct, but it is possible to determine the quantity of the sub-sample. The ABC-LAMP method was applied to the result of successful design and measurement of LAMP of the genetic component. In addition, the principle of this method has been successfully applied to the development of hepatitis C virus activity assay and leukemia virus assay.