高機能植物への応用を目指した植物ホウ素トランスポーターBOR1の構造・機能解析

1.BOR4タンパク質の大量精製系の確立および結晶化条件のスクリーニングBOR4-TEVプロテアーゼ切断認識配列-GFP-6xHisをGAL1プロモーター制御下で発現する出芽酵母からn-dodecyl-ss-D-maltoside(DDM)により可溶化したHis-Tagタンパク質をコバルトレジンにより精製した。TEVプロテアーゼによりGFP-6xHisを除去した。培養時間の選定、各ステップで使用するバッファーの組成を検討することで、12Lの培養液から約0.5mgの精製BOR4を抽出できるようになった。CPM assay[Alexandrov et al.Structure, 16:351-359(2008)]により精製BOR4の熱安定性を調べた。40℃においてBOR4が完全に変性するまでの半減期は44.3分であった。結晶化に有利な分子量の小さな界面活性剤であるn-nonyl-ss-D-glucoside(NG)またはn-octyl-ss-D-glucoside(OG)を添加すると半減期はそれぞれ21.3分および19.9分に減少した。DDMのNG、ONへの置き換えは困難であると思われる。さらに精製BOR4を用いてMemGold kit(Molecular Dimensions社)による結晶化条件のスクリーニングを行った。4℃および20℃においてそれぞれ96条件ずつのスクリーニングに供しているが結晶は得られていない。2.ホウ素濃度依存的なユビキチン化によるBOR1の分解制御野生型BOR1-GFP及び分解が起きない変異型BOR1(K590A)-GFPを発現するシロイヌナズナの根からマイクロソーム画分を調製し、抗GFP抗体による免疫沈降,抗ユビキチン抗体によるウエスタン解析を行い、B過剰環境に応答して一つもしくは二つのユビキチンがBOR1-GFPに結合すうことを明らかにした。一方、BOR1(K590A)-GFPではユビキチン化は検出されなかった。これらの結果から、K590残基のB濃度応答したユビキチン化が、B過利条件でBOR1を分解に向かわせる主要なシグナルであることが明らかになった。K590のユビキチン化の役割を詳細に調べるために、メンブレントラフィック阻害剤であるブレフェルジンAがBOR1-GFPとBOR1(K590A)-GFPのトラフィッキングに及ぼす影響を調べた。BFA処理によりBOR1(K590A)-GFPがBOR1-GFP同様にエンドソーム凝集体に観察されることから、K590のB濃度依存的ユビキチン化はBOR1の細胞膜からのエンドサイトーシスではなく、初期エンドソーム以降の輸送段階を制御することが示唆された。

1.BOR4タンパク質の大量精製系の確立および結晶化条件のスクリーニングBOR4-TEVプロテアーゼ切断認識配列-GFP-6xHisをGAL1プロモーター制御下で発現する出芽酵母からn-dodecyl-ss-D-maltoside(DDM)により可溶化したHis-Tagタンパク質をコバルトレジンにより精製した。TEVプロテアーゼによりGFP-6xHisを除去した。培養時間の選定、各ステップで使用するバッファーの組成を検討することで、12Lの培養液から約0.5mgの精製BOR4を抽出できるようになった。CPM assay[Alexandrov et al.Structure, 16:351-359(2008)]により精製BOR4の熱安定性を調べた。40℃においてBOR4が完全に変性するまでの半減期は44.3分であった。結晶化に有利な分子量の小さな界面活性剤であるn-nonyl-ss-D-glucoside(NG)またはn-octyl-ss-D-glucoside(OG)を添加すると半減期はそれぞれ21.3分および19.9分に減少した。DDMのNG、ONへの置き換えは困難であると思われる。さらに精製BOR4を用いてMemGold kit(Molecular Dimensions社)による結晶化条件のスクリーニングを行った。4℃および20℃においてそれぞれ96条件ずつのスクリーニングに供しているが結晶は得られていない。2.ホウ素濃度依存的なユビキチン化によるBOR1の分解制御野生型BOR1-GFP及び分解が起きない変異型BOR1(K590A)-GFPを発現するシロイヌナズナの根からマイクロソーム画分を調製し、抗GFP抗体による免疫沈降,抗ユビキチン抗体によるウエスタン解析を行い、B過剰環境に応答して一つもしくは二つのユビキチンがBOR1-GFPに結合すうことを明らかにした。一方、BOR1(K590A)-GFPではユビキチン化は検出されなかった。これらの結果から、K590残基のB濃度応答したユビキチン化が、B過利条件でBOR1を分解に向かわせる主要なシグナルであることが明らかになった。K590のユビキチン化の役割を詳細に調べるために、メンブレントラフィック阻害剤であるブレフェルジンAがBOR1-GFPとBOR1(K590A)-GFPのトラフィッキングに及ぼす影響を調べた。BFA処理によりBOR1(K590A)-GFPがBOR1-GFP同様にエンドソーム凝集体に観察されることから、K590のB濃度依存的ユビキチン化はBOR1の細胞膜からのエンドサイトーシスではなく、初期エンドソーム以降の輸送段階を制御することが示唆された。