Group II型シャペロニンの機能解析および反応機構の解明

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本年度では、超好熱古細菌由来グループIIシャペロニンの低温適応化、Group II型シャペロニンとプレフォルディンの相互作用解析を中心に研究を行った。我々の研究室では、in vitroにおいて唯一高い活性を有する超好熱性古細菌Thermococus sp.Strain KS-1由来グループII型シャペロニンを用いて、反応機構解析を行ってきたが、60度以上の高温でのみ高い活性を示すことから、解析に使用できる実験機器に制限があった。そこで本年度では、超好熱性古細菌由来グループII型シャペロニンが比較的室温でも機能するように、超好熱菌由来シャペロニンの低温適応化を試みた。本研究では、高温菌種と常温菌種の計43種間で、シャペロニンサブユニットのアミノ酸配列のアライメントを行い、高温菌と常温菌と間でそれぞれ強く保存されているアミノ酸残基を解析した。各生育種で保存されているアミノ酸残基の違いが、各生育温度でのシャペロニンの活性の違いに大きく起因すると推定し、超好熱菌由来シャペロニンサブユニット内の高温で保存されているアミノ酸残基を、低温で保存されているアミノ酸残基に置換し、低温適応化を試みた。こうして作製したシャペロニン変異体を解析した結果、比較的室温とされる40度で、蛋白質折れたたみ活性の改善がみられた。この背景として、シャペロニンの基質捕捉能とATP依存的な構造変化能が低温で上昇していたことが明らかとなった(論文Protein Eng.Des.Sel.受理34th FEBS Congress国際学会にてOral presentation採択)。また、前年度より解析している、グループII型シャペロニンとプレフォルディンの相互作用解析では、以前申請者が構築した「シャペロニンサブユニット連結法」を用いて(Kanzaki et.al, J.Biol.Chem., 2008)、「プレフォルディンとaffinityの高いシャペロニンサブユニット」と「affinity低いサブユニット」を様々に配置したシャペロニン複合体を作成し、シャペロニンとプレフォルディンの相互作用機構の解析を行った(論文BBA受理)。