HIVの潜伏感染・再活性化におけるエピジェネティック制御機構の解析

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平成20年度は、昨年度に引き続き「siRNAによるウイルス遺伝子発現制御機構のサルにおけるモデル系確立」に焦点を当て研究を進めた。咋年度、SIV LTRプロモーター領域を標的としたsiRNAによるウイルス増殖抑制効果を示した。今年度、これらsiRNAによるtranscriptional gene silencing(TGS)効果を明らかにすることを目的とし、LTR-Luciferase(Lus)発現ベクターを用いたレポーターアッセイを行った。その結果、LTRプロモーター活性はNF-kB結合領域に設計したsiRNAにより抑制されたが、その上流領域に設計したsiRNAでは抑制されなかった。上記siRNAの標的配列はウイルスmRNA上にも存在し、post transcriptional gene silencing(PTGS)としても働き得る。よって、CMVプロモーターで発現誘導されるLuc-LTR連結ベクターを作成し、PTGS効果を評価した。その結果、全てのsiRNAによりLucの発現が抑制された。以上より、NF-kB結合領域に設計したsiRNAはTGSとPTGS両方の効果を有し、その上流領域に設計したsiRNAはPTGS効果のみを有することが明らかとなった。これらsiRNA配列について血球細胞株におけるヘアピン型dsRNA stable発現細胞を確立し、SHIV感染実験を行った。その結果、NF-kB結合領域に設計したdsRNA発現細胞株ではウイルス増殖が1年以上抑制された。一方、NF-kB上流領域に設計したdsRNA発現細胞株では感染初期には抑制効果が見られたが、感染1ヶ月後以内には完全に抑制が解除された。以上より、長期的なウイルス増殖抑制の持続にはsiRNAによるTGSの誘導が重要であり、今回NF-kB結合領域に作成したsiRNAがサルモデル系におけるウイルス抑制効果の実験に有効であることが示された。