tRNAプロセシング酵素RNase Pのサブユニット間相互作用に関する研究

tRNA加工酶RNase P亚基间相互作用的研究

• 批准号: 07J09329
• 负责人: 木房 まゆみ
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J09329/
• 关键词: リボヌクレアーゼP; tRNAプロセシング; リボザイム; タンパク質間相互作用; Two-hybridシステム; RNase P; Pyrococcus horikoshii; protein-protein interaction; Two-hybrid system

リボヌクレアーゼP(RNase P)は、前駆体tRNAの5'リーダー配列のプロセシングに関与するエンドヌクレアーゼである。超好熱古細菌Pyrococcus horikoshii由来RNase Pは、触媒活性を持つ1分子のRNA(PhopRNA)と5種のタンパク質(PhoPop5、PhoRpp21、PhoRpp29、PhoRpp30、PhoRpp38)から構成され、4種のタンパク質(PhoPop5、PhoRpp21、PhoRpp29、PhoRpp30)はPhopRNAの分子シャペロンとして機能し、PhoRpp38はPhopRNAと特異的に相互作用してその耐熱性に関与していることが明らかになっている。本研究では、5種のタンパク質の相互作用について分析するとともに、タンパク質PhoRpp38とPhopRNAの相互作用について検討した。まず、各タンパク質の相互作用を酵母Two-hybridシステムにより検討した結果、PhoPop5とPhoRpp30およびPhoRpp21とPhoRpp29が強く相互作用し、PhoPop5とPhoRpp21が弱く相互作用していることが解った。さらに、RNase Pの熱耐性に関与しているタンパク質PhoRpp38は、いずれのタンパク質とも相互作用していないことが示唆された。以上の結果より、2種のタンパク質複合体(PhoRpp30-PhoPop5)と(PhoRpp21-PhoRpp29)がPhoPop5とPhoRpp21の弱い相互作用により、複合体(PhoRpp30-PhoPop5-PhoRpp21-PhoRpp29)を形成していることが示唆された。次に、PhopRNAのPhoRpp38結合部位をフットプリンティング法を用いて検討した。まず、PhoRpp38の存在下および非存在下でPhopRNAをジメチル硫酸で修飾後、PhopRNAの修飾塩基をプライマー伸長反応により同定した。その結果、PhopRNAのC^<190>、A^<227>、A^<228>、A^<234>、C^<243>、A^<245>、A^<261>、A^<272>がPhoRpp38の存在下でジメチル硫酸による修飾から保護されることが解った。この結果とSELEX法を用いたPhoRpp38と特異的に結合するアプタマーの塩基配列を考慮して、PhoRpp38はPhopRNAのヘリックスP12-1とP12-2およびヘリックスP15の2箇所に結合することにより、PhopRNAの耐熱性の上昇に寄与していることが示唆された。

核糖核酸酶P（RNase P）是涉及处理前体tRNA的5'领导者序列的内切酶。来自高疗法的RNase P，horikoshii，由一个具有催化活性和五种蛋白质的RNA分子（Phopop5，Phorpp21，Phorpp21，Phorpp29，Phorpp29，Phorpp30，Phorpp30，Phorpp38）和四个蛋白（Phopop5，Phorec5，Phorpp59，Phorec59，Phorec529） phoprna的伴侣，已经揭示了Phorpp38与Phoprna专门相互作用，并参与其耐热性。在这项研究中，我们分析了五种蛋白质之间的相互作用，并检查了蛋白质phorpp38和phoprna之间的相互作用。首先，我们使用酵母双杂交系统研究了每种蛋白质的相互作用，发现Phopop5和Phorpp30，Phorpp21和Phorpp29相互作用很强，而Phopop5和Phorpp21相互作用弱相互作用。此外，有人提出，与RNase P的热耐受性有关的Phorpp38不会与任何蛋白质相互作用。以上结果表明，由于phopop55和phorpp21的弱相互作用，由于弱相互作用而导致的两个蛋白质复合物（Phorpp30-Phopop5）和（Phorpp21-Ph​​orpp29）形成复合物（Phorpp30-Phorpp5-Phorpp21-Ph​​orpp29）。接下来，使用足迹检查了Phoprna的Phorpp38结合位点。首先，在存在和不存在phorpp38的情况下用硫酸二甲基二甲基修饰的phoprna，然后通过引物延伸反应鉴定了phoprna的修饰碱。结果表明，c^<190>，a^<227>，a^<228>，a^<234>，c^<243>，a^<245>，a^<261>，a^<272>，a^<272>在phorppp38的存在中受到二甲基硫酸盐的修饰。考虑到这种结果和适体的基本序列，使用SELEX方法专门与Phorpp38结合，建议Phorpp38与Phoprna的P12-1和P12-1和P12-2和Helix P15结合，有助于Phoprna的耐热性增加。