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転写における人工塩基対の選択性と効率に影響を及ぼす鋳型DNA塩基配列の網羅的解析

综合分析影响人工碱基对转录选择性和效率的模板DNA碱基序列

基本信息

批准号：
18710197
负责人：
木本路子
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18710197/
关键词：
人工塩基対 RNA 転写 DNA 蛍光基 PCR セレクションライブラリービオチン栄光基

项目摘要

今年度は、当研究室で開発された、転写と複製で機能する人工塩基対(Ds-Pa、Ds-Pn)を用いて、転写で人工塩基取り込み選択性に効率に影響を及ぼす人工塩基近傍のDNA塩基配列の網羅的解析に取り組んだ。Dsの両側4塩基をランダムにした塩基配列を含むDNAライブラリーを調製し、(1)蛍光基(FAM)を結合したPa(FAM-Pa)の基質存在下で転写を行い、(2)得られた転写産物からFAM-Paを含むRNAを抗FAM抗体により単離し、(3)このRNAをDs-Pnの基質存在下でRT-PCRを行って(1)に必要な鋳型を調製する、というセレクションを繰り返した。その結果、最初のDNAライブラリーから転写された産物中へのFAM-Paの取り込みは、その蛍光強度から判断して効率良く進行したが、2ラウンド目の転写でFAM-Paの取り込みが大きく減少し、3ラウンド目以降で再び効率は上がるが最初のラウンドの取り込み効率の高さまで濃縮されていないことがわかった。これは人工塩基が天然型塩基に置き換わった核酸断片が混入した結果と考えられた。そこで、天然型塩基のみの核酸断片を確実に除くステップを加えることにより、実験系を改善することにし、今年度後半は、天然型塩基のみのDNA断片が過剰に存在するDNAライブラリーから、FAM-Pnを含むDNA断片を効率よく選択する条件の確立に重点的に取り組んだ。一方、3ラウンドのセレクションを行った後に得られたDNAの塩基配列を解析した結果、昨年度実施した複製でのセレクションと異なったDs近傍の配列が得られた。本研究課題で実施した以上の結果より、人工塩基対近傍の天然塩基の配列が、複製や転写における人工塩基対の取り込みの選択性に大きく関与していることがわかってきた。

This year, when the laboratory was opened to develop, write and copy functions, artificial DNA pairs (Ds-Pa, Ds-Pn) were used, the effects of artificial DNA base selection on selectivity were studied, and the analysis of DNA base alignment near artificial DNA base was selected. Ds-Pn substrate is composed of four groups: (1) FAM group (FAM), FAM-Pa (FAM-Pa), FAM-Pa (FAM As a result, FAM-Pa was selected from the initial DNA sequence, and its fluorescence intensity was determined to be high in efficiency. 2. FAM-Pa was selected from the initial DNA sequence to be low in efficiency. 3. FAM-Pa was selected from the initial DNA sequence to be high in efficiency. The artificial DNA fragments were mixed with the natural DNA fragments. In addition, the selection of DNA fragments containing FAM-Pn and DNA fragments containing FAM-Pn is important for the establishment of conditions for the improvement of the system. The results of DNA sequencing were analyzed and compared with the results of DNA sequencing in the previous year. This research topic is based on the above results, artificial matrix is close to the natural matrix of the alignment, replication and writing, artificial matrix is close to the selection of the center of the selection of the large and medium-sized.