化学修飾によって蛋白質を神経細胞表面の特定の部位に局在化させる

・GFPのC末端コレステロール修飾体の細胞への応用結果先に受けた科学研究費補助金によりインテイン蛋白質との融合蛋白質を利用した蛋白質C末端の選択的な修飾系を構築した。目的物はフラグメント縮合を通して得られるが、蛋白質変性を伴うHPLCのような精製法では、その後の巻き戻し反応が非常に困難であることが判明した。そこで縮合反応における試薬を徹底的に除去限外ろ過で除去し、細胞への添加実験のサンプルとした。本年度は懸案であったC末端をコレステロールで修飾したGFP(以下GFP-Chol)をマウス神経芽細胞であるN2aの培養液中に添加して、洗浄後蛍光顕微鏡下での観察を行った。その結果、GFP-Cho1は細胞膜表面に結合していることが確認された。一方、非修飾のGFPは洗浄時に洗い流され、同一条件下において観測できなかった。しかしながら、 GFP-Cholの長時間のインキュベーションでは細胞障害がみられた。そこでこの原因を探るべく低分子の蛍光標識コレステロールの調製をおこない、同様の観察を行ったところ大きな障害は見られず、膜表面に結合することがわかった。そのためGFP-Cholにおいて観察された細胞障害は細胞膜に結合したGFPに誘起されることが示唆される。現在はこの原因を探る実験と並行してプリオン蛋白質コレステロール修飾系の応用をすすめている。プリオン蛋白質に関しては巻き戻しに関して有用な基準がないため、その異常化をもって評価を進めているが異常化を検出するにいたっていない。

・GFPのC末端コレステロール修飾体の細胞への応用結果先に受けた科学研究費補助金によりインテイン蛋白質との融合蛋白質を利用した蛋白質C末端の選択的な修飾系を構築した。目的物はフラグメント縮合を通して得られるが、蛋白質変性を伴うHPLCのような精製法では、その後の巻き戻し反応が非常に困難であることが判明した。そこで縮合反応における試薬を徹底的に除去限外ろ過で除去し、細胞への添加実験のサンプルとした。本年度は懸案であったC末端をコレステロールで修飾したGFP(以下GFP-Chol)をマウス神経芽細胞であるN2aの培養液中に添加して、洗浄後蛍光顕微鏡下での観察を行った。その結果、GFP-Cho1は細胞膜表面に結合していることが確認された。一方、非修飾のGFPは洗浄時に洗い流され、同一条件下において観測できなかった。しかしながら、 GFP-Cholの長時間のインキュベーションでは細胞障害がみられた。そこでこの原因を探るべく低分子の蛍光標識コレステロールの調製をおこない、同様の観察を行ったところ大きな障害は見られず、膜表面に結合することがわかった。そのためGFP-Cholにおいて観察された細胞障害は細胞膜に結合したGFPに誘起されることが示唆される。現在はこの原因を探る実験と並行してプリオン蛋白質コレステロール修飾系の応用をすすめている。プリオン蛋白質に関しては巻き戻しに関して有用な基準がないため、その異常化をもって評価を進めているが異常化を検出するにいたっていない。