非閉塞性胆汁うっ滞病変の機序解明と高圧酸素療法による改善効果

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ラット小型肝細胞を用いた,病態解析モデルの確立<方法>(1)成熟ラット肝よりコラゲナーゼ潅流法により小型肝細胞を分離,培養を行いin vitroで類肝組織を構築した。(2)細胞膜トランスポーター(Oatpt,Ntcp,Mrpt,Mdr,Bsep,Bcrp)の遺伝子発現をRT-PCR法で定量化し,さらにそれらトランスポーター蛋白の細胞膜上への局在を免疫染色法で検討を行った。肝細胞トランスポーターの発現には,どのような核内転写因子(HNFt、C/EBPなど)あるいは,ホルモンレセプター(CAR,PXR,RXRなど)が関与し制御しているかをRT-PCR法によりその遺伝子発現の変化から検討した。(3)トランスポーターの安定発現した類肝組織において肝細胞におけるRI基質(Ettoron Sulfate,Estradiol glucronideなど)の細胞内への取り込み,細胞外への排泄を測定することにより輸送能を定量化し,in vitroにおける基質(胆汁)輸送を検討した。<結果>(1)小型肝細胞コロニカの経時的変化:肝細胞培養初期は,小型の実質細胞からなるコロニーを形成した。培養12日目に再播種後,細胞は成熟化し三次元構造をとり細胞間には毛細胆管構造を形成するようになった。(2)小型肝細胞成熟化に伴う肝細胞膜トランスポーターの発現:類洞側細胞膜上に発現する取り込み型有機アニオントランスポーター(Oatp1/2/4),毛細胆管側細胞膜上に発現する排泄型有機アニオントランスポーター(Mrp2)は,成熟肝細胞と比較し発現は低いが,成熟化するに従いその発現量は上昇した。また,これらの発現上昇には肝転写因子HNF4,ホルモンレセプターCARとの関連が示された。(3)小型肝細胞内への有機アニオン基質の取り込み,排泄:培養液中に投与された,Estoron Sulfateの細胞内への取り込み,およびEstradiol glucronideの毛細胆管への排泄は,培養日数が増し細胞が成熟化するに従い増加した。<考察>小型肝細胞の有機アニオントランスポーターの発現,有機アニオン輸送形態はin vitroにおける胆汁うっ滞病変解析モデルとして有用と考えられた。