ペルフルオロ化合物の肝臓における高蓄積性の分子メカニズムの解明

本研究では、Perfluorooctanoic acid(PFOA)をはじめとするペルフルオロ化合物が肝臓に蓄積する原因は、細胞内の高親和性分子と結合することにより特定の細胞内コンパートメントに保持されるためであるとの作業仮説のもとに、肝臓における標的因子の探索を行っている。肝細胞内のタンパク質とPFOAの結合を維持した状態で解析を行うため、blue-native polyacrylamide gel electrophoresis(BN-PAGE)について検討した。BN-PAGEはSDSのような変性剤を用いず、生理的pHで泳動するためタンパク質複合体の分離にも用いられる。はじめにラット肝細胞の各画分のタンパク質の可溶化条件の最適化を行った。さらに予備的検討としてウシ血清アルブミンと14-C標識PFOAの結合を維持しながらバンドを分離できることを確認した。したがってこれらの可溶化された画分を泳動することで特異的な結合タンパク質の検出が可能となった。また、高親和性分子の存在するコンパートメントへの受け渡しを行うキャリアー分子として、脂肪酸結合タンパク質(FABP:fatty acid binding protein)に着目し、PFOAの細胞内蓄積におけるFABPの寄与について明らかにすることを目的として実験を行った。培養細胞を用いたin vitro取り込み実験を行うため、CMVプロモータおよびネオマイシン耐性遺伝子を有するpCI-neoにラットL-FABP遺伝子を組み込み、L-FABPの発現ベクターを構築した。

本研究では、Perfluorooctanoic acid(PFOA)をはじめとするペルフルオロ化合物が肝臓に蓄積する原因は、細胞内の高親和性分子と結合することにより特定の細胞内コンパートメントに保持されるためであるとの作業仮説のもとに、肝臓における標的因子の探索を行っている。肝細胞内のタンパク質とPFOAの結合を維持した状態で解析を行うため、blue-native polyacrylamide gel electrophoresis(BN-PAGE)について検討した。BN-PAGEはSDSのような変性剤を用いず、生理的pHで泳動するためタンパク質複合体の分離にも用いられる。はじめにラット肝細胞の各画分のタンパク質の可溶化条件の最適化を行った。さらに予備的検討としてウシ血清アルブミンと14-C標識PFOAの結合を維持しながらバンドを分離できることを確認した。したがってこれらの可溶化された画分を泳動することで特異的な結合タンパク質の検出が可能となった。また、高親和性分子の存在するコンパートメントへの受け渡しを行うキャリアー分子として、脂肪酸結合タンパク質(FABP:fatty acid binding protein)に着目し、PFOAの細胞内蓄積におけるFABPの寄与について明らかにすることを目的として実験を行った。培養細胞を用いたin vitro取り込み実験を行うため、CMVプロモータおよびネオマイシン耐性遺伝子を有するpCI-neoにラットL-FABP遺伝子を組み込み、L-FABPの発現ベクターを構築した。