Conformational dynamics during the catalytic cycle of RNA helicases studied by time-resolved fluorescence resonance energy transfer (FRET) and single molecule FRET

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RNA-Helikasen katalysieren die ATP-abhängige Entwindung doppelsträngiger RNA in zellulären Schlüsselprozessen, die RNA-Umstrukturierung erfordern. Die Helikase-Aktivität wird vermutlich über nukleotidgesteuerte Konformationsänderungen moduliert. In DEAD-Box-Helikasen verhindern Mutationen im hochkonservierten SAT-Motiv die Kopplung von Nukleotidbindung und RNA-Entwindung. Die molekularen Grundlagen für den Entwindungsprozess sind jedoch unbekannt. Ich beabsichtige, nukleotid- und substratabhängige Konformationsänderungen in RNA-Helikasen sowie Änderungen der Substratkonformation mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie zu untersuchen. Mit Fluoreszenzresonanzenergietransfer können Abstände im Bereich von 20-80 Å bestimmt werden. Die Korrelation von Konformationsänderungen der Helikase mit der Entwindungsaktivität wird aufzeigen, wie Helikasen die chemische Energie der ATP-Hydrolyse zum Entwinden von Helizes verwenden. Einzelmolekülexperimente werden die zeitliche Abfolge von Konformationen und damit einen Konformationszyklus definieren. Vergleiche mit Helikasen psychrophiler Organismen werden Aufschluss geben, welche spezifischen Eigenschaften es ihnen ermöglichen, die höhere Stabilität von RNA-Strukturen bei niedriger Temperatur zu überwinden. RNA-Helikasen sind möglicherweise generell an der Faltung großer RNA-Moleküle beteiligt.