睡眠覚醒リズムを制御するカルシウムシグナル関連因子のシステム生物学的解析

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本研究課題では、動物において普遍的に観察される睡眠覚醒リズムを対象として、Ca2+シグナルによる生体リズム形成機構を解明することを目的としている。睡眠中・覚醒中の脳からはそれぞれに特徴的な神経発火パターン（睡眠時は低頻度、覚醒時は高頻度）が計測されるが、過去の数理的解析から、これら二つの状態間の遷移は、細胞膜上の電位依存型Ca2+チャネル、NMDA型グルタミン酸受容体、Ca2+依存性K+チャネル、Ca2+ポンプのうちのいずれか一つ以上にCa2+透過性の変化が起きた結果として生じることが明らかになっているが、これら分子群の睡眠覚醒リズムに対する寄与を示す実験的証拠はほとんど得られていない。平成２８年度は、上記分子群のうち細胞膜Ca2+ポンプ（PMCA）に焦点を絞り解析を行った。まず、マウス脳に発現しているPMCAのクローニングを行い、4種類のアイソフォーム（そのうち2種はスプライスバリアントを持つ）を同定した。続いて、PMCA細胞内領域の全てのセリン・スレオニン・チロシン残基を対象にして非リン酸化変異（アラニン）・疑似リン酸化変異（アスパラギン酸）を加えた模倣体を網羅的に作製し、合計168種の変異体を得た。また対照として機能欠損型変異体および恒常活性型変異体も作製した。これらすべての変異体のCa2+輸送特性を大規模並列測定するために、蛍光マイクロプレートリーダーを用いたカルシウムイメージングシステムを確立し、PMCA変異体を発現したHEK293細胞の細胞内Ca2+動態の時系列解析を行った。一次スクリーニングにより、Ca2+ポンプ活性調節に関わる標的リン酸化部位の候補が40アミノ酸見つかり、現在更なる解析を行っている。