熱応答性磁性ナノ粒子を用いたクリプトスポリジウム遺伝子の高感度検出法の開発

利用热响应磁性纳米颗粒开发高灵敏度隐孢子虫基因检测方法

• 批准号: 16K06553
• 负责人: 関川 貴寛
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: University of Shizuoka
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-10-21 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16K06553/
• 关键词: クリプトスポリジウム; 界面活性剤抽出処理; 熱応答性高分子; 磁性ナノ粒子; 免疫磁気分離; 核酸抽出; リアルタイムPCR; オーシスト; 界面活性剤; 免疫磁気ビーズ

我々はアビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子（Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP）とCryptosporidium parvumに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてオーシスト回収用の熱応答性免疫磁性ナノ粒子（Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP）を開発した。また、クリプトスポリジウムのオーシストから核酸を抽出する界面活性剤抽出処理（Surfactant extraction treatment: SET）とTIMNPの併用法（TIMNP-SET法）を用いたオーシスト18S rDNAの検出に成功している。平成29年度は、TIMNP-SET法を用いて河川水からのC. paruvumオーシストの回収およびDNAの検出条件を検討した。オーシストDNAの検出には、クリプトスポリジウム18S rDNAに特異的なプライマーセットとTaqManプローブを用いた。TIMNPの粒子濃度は4 mg/mLに調整した。C. parvum DNAとTIMNPを含む試料水に陰イオン界面活性剤SDS（終濃度0.1％）を添加した後、加熱処理（90℃、15分間）で核酸を抽出し、加熱処理後のTIMNPがリアルタイムPCRに及ぼす影響を評価した。その結果、TIMNP濃度1％由来のPCR阻害はTween20添加では抑制されないが、SDS処理のみで抑制されることがわかった。また、蒸留水750 μL にオーシスト100000個を添加してクリプトスポリジウム汚染水を調製し、TIMNP-SET法を用いてオーシストの回収およびリアルタイムPCR法によるDNAの検出感度を評価した。その結果、PCR試薬中のTIMNP濃度が1％でもPCR阻害が抑制され、オーシスト由来DNAを高感度に検出できることが確認された。

我们使用抗原蛋白结合的热响应性磁性纳米颗粒（TMNP）和生物素基化的单克隆抗体，开发了用于卵囊的热响应性免疫磁纳米颗粒（TIMNPS）。此外，使用表面活性剂提取处理（SET）成功检测到卵囊18S rDNA，该处理从隐孢子虫的卵囊中提取核酸和TIMNP（TIMNP-set）的组合。 2017年，使用TIMNP-stet方法研究了从河水中回收杜松子梭菌卵囊和DNA的检测条件。为了检测卵囊DNA，使用了针对隐孢子虫18S rDNA和Taqman探针的底漆集。将TIMNP的颗粒浓度调节到4 mg/ml。将阴离子表面活性剂SD（最终浓度0.1％）添加到含有parvum c. parvum DNA和TIMNP的样品水中后，通过加热（90°C）提取核酸（持续15分钟），并评估TIMNP对实时PCR的TIMNP效果。结果，发现由于TIMNP浓度为1％引起的PCR抑制作用不会被Tween20添加抑制，而是仅被SDS治疗抑制。此外，将100,000个卵囊添加到750μl蒸馏水中以制备隐孢子虫污染的水，并使用TIMNP-SET方法评估了卵囊的回收和通过实时PCR进行DNA检测的敏感性。结果，已经证实，即使PCR试剂中的TIMNP浓度为1％，PCR抑制也得到了抑制，并且可以高灵敏度检测到卵囊衍生的DNA。

项目成果

Development of thermo-responsive magnetic nanoparticles for Cryptosporidium oocyst recovery

用于隐孢子虫卵囊回收的热响应磁性纳米粒子的开发

• 发表时间: 2017
• 作者: Sekikawa T.;Ohnishi N.;Xie X.
• 通讯作者: Xie X.

IMS-SET and RT-LAMP for sensitive detection of Cryptosporidium parvum oocysts in river water

IMS-SET 和 RT-LAMP 用于灵敏检测河水中的隐孢子虫卵囊

• 发表时间: 2017
• 作者: Sekikawa T.;Ohnishi N.;Xie X.;Sekikawa T.
• 通讯作者: Sekikawa T.

A simple method for detecting Cryptosuporidium parvum oocysts in water resources by IMS-SET and LAMP

IMS-SET和LAMP检测水资源中隐孢子虫卵囊的简便方法

• 发表时间: 2017
• 作者: 阿部貴弘;松下直道;髙橋一希・阿部貴弘;加藤賢一・阿部貴弘;Sekikawa T.
• 通讯作者: Sekikawa T.