熱応答性磁性ナノ粒子を用いたクリプトスポリジウム遺伝子の高感度検出法の開発

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我々はアビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子（Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP）とCryptosporidium parvumに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてオーシスト回収用の熱応答性免疫磁性ナノ粒子（Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP）を開発した。また、クリプトスポリジウムのオーシストから核酸を抽出する界面活性剤抽出処理（Surfactant extraction treatment: SET）とTIMNPの併用法（TIMNP-SET法）を用いたオーシスト18S rDNAの検出に成功している。平成29年度は、TIMNP-SET法を用いて河川水からのC. paruvumオーシストの回収およびDNAの検出条件を検討した。オーシストDNAの検出には、クリプトスポリジウム18S rDNAに特異的なプライマーセットとTaqManプローブを用いた。TIMNPの粒子濃度は4 mg/mLに調整した。C. parvum DNAとTIMNPを含む試料水に陰イオン界面活性剤SDS（終濃度0.1％）を添加した後、加熱処理（90℃、15分間）で核酸を抽出し、加熱処理後のTIMNPがリアルタイムPCRに及ぼす影響を評価した。その結果、TIMNP濃度1％由来のPCR阻害はTween20添加では抑制されないが、SDS処理のみで抑制されることがわかった。また、蒸留水750 μL にオーシスト100000個を添加してクリプトスポリジウム汚染水を調製し、TIMNP-SET法を用いてオーシストの回収およびリアルタイムPCR法によるDNAの検出感度を評価した。その結果、PCR試薬中のTIMNP濃度が1％でもPCR阻害が抑制され、オーシスト由来DNAを高感度に検出できることが確認された。