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熱応答性磁性ナノ粒子を用いたクリプトスポリジウム遺伝子の高感度検出法の開発

利用热响应磁性纳米颗粒开发高灵敏度隐孢子虫基因检测方法

基本信息

批准号：
16K06553
负责人：
関川貴寛
金额：
$ 2.91万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-10-21 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はアビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子（Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP）とCryptosporidium parvumに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてオーシスト回収用の熱応答性免疫磁性ナノ粒子（Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP）を開発した。また、クリプトスポリジウムのオーシストから核酸を抽出する界面活性剤抽出処理（Surfactant extraction treatment: SET）とTIMNPの併用法（TIMNP-SET法）を用いたオーシスト18S rDNAの検出に成功している。平成29年度は、TIMNP-SET法を用いて河川水からのC. paruvumオーシストの回収およびDNAの検出条件を検討した。オーシストDNAの検出には、クリプトスポリジウム18S rDNAに特異的なプライマーセットとTaqManプローブを用いた。TIMNPの粒子濃度は4 mg/mLに調整した。C. parvum DNAとTIMNPを含む試料水に陰イオン界面活性剤SDS（終濃度0.1％）を添加した後、加熱処理（90℃、15分間）で核酸を抽出し、加熱処理後のTIMNPがリアルタイムPCRに及ぼす影響を評価した。その結果、TIMNP濃度1％由来のPCR阻害はTween20添加では抑制されないが、SDS処理のみで抑制されることがわかった。また、蒸留水750 μL にオーシスト100000個を添加してクリプトスポリジウム汚染水を調製し、TIMNP-SET法を用いてオーシストの回収およびリアルタイムPCR法によるDNAの検出感度を評価した。その結果、PCR試薬中のTIMNP濃度が1％でもPCR阻害が抑制され、オーシスト由来DNAを高感度に検出できることが確認された。

We use the response immunomagnetic particles (Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP) to detect the immune response of magnetic particles (Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP). Nucleic acid extraction, interfacial activity extraction, TIMNP extraction (Surfactant extraction treatment: SET), TIMNP extraction (TIMNP-SET method), successful nucleic acid extraction (18s DNA extraction). In the year of Pingcheng 29, the TIMNP-SET method was used to determine the conditions of the river water, the paruvum, the river, the DNA, the river, the river and the river. Please tell me that the DNA is not available, and that the 18s rDNA special device is not used. The TaqMan is not used. TIMNP Particle size 4 mg/mL rectifier. C. Parvum DNA TIMNP contains the interfacial active SDS (temperature 0.1%) of raw materials and water. After adding temperature, adding temperature (90 ℃, 15 minutes), adding temperature (90 ℃, 15 minutes), adding temperature, TIMNP, temperature, temperature and temperature. The results show that the TIMNP degree 1% is due to the fact that PCR blocks the addition of the Tween20 to suppress the symptoms, and the SDS causes the suppression of the symptoms. In 100000 samples of distilled water, 750μ L distilled water was added, and the sensitivity was detected by TIMNP-SET method. The sensitivity was detected by DNA method. The results showed that the TIMNP in PCR was 1%, the PCR was blocked, the inhibition was detected, and the cause of DNA was high sensitivity.