細胞内小器官形成に必要なp97ATPase膜融合の新規必須因子p55の分子機能

細胞内小器官であるゴルジ体・小胞体の形成・維持のために、二つの異なるp97膜融合経路、即ちp97/p47経路とp97/p37 経路が必要である。p97/p47経路は細胞分裂期における細胞内小器官の再構成に働き、もう一つのp97/p37経路は細胞周期間期における細胞内小器官の維持に働く。申請者は、p97/p47経路がゴルジ体形成に機能するための新規必須因子p55 を単離同定している。本研究では、そのp55の分子機構を明らかすることを目的とし、p97ATPase膜融合の新規必須因子p55を含む「機能的複合体」の単離同定を試みた。ラット肝臓から調製したゴルジ体膜を可溶化し抗p55抗体を用いた免疫沈降によりp55を含む複合体を単離した結果、約400kDaのタンパク質を得ることができた。このタンパク質を質量分析により解析した結果、ゴルジ体に局在するタンパク質Giantinであることが判明した。GiantinはNSF経路でtetheringに関係して機能することが知られている因子である。よって、Giantin/p55が、p97/p47経路において、tethering因子として機能する可能性が考えられた。この可能性を検証するため、可溶化したゴルジ体膜溶液をスクロース密度勾配遠心法により分画し、p55を含むGiantin画分のみから抗Giantin抗体とProteinG-beadsを用いてp55/Giantin-beadsを作製し、そのbeadsにp97やp47を加え、beads-Giantin/p55-p97-p47-p55/Giantin-beadsが形成されるかをbeadsのaggregationの観察によりおこなった。その結果、p97、p47両方を加えるとbeadsはaggregationし、p97単独やp47単独ではbeadsのaggregationは観察されなかった。また、p55を含まないGiantin画分を使用した場合では、p97、p47両方を加えても、beadsのaggregationは観察されなかった。よって、Giantin/p55-p97-p47-p55/Giantinという巨大な複合体が存在し、p97/p47経路において、tetheringとして機能している可能性が示唆された。

細胞内小器官であるゴルジ体・小胞体の形成・維持のために、二つの異なるp97膜融合経路、即ちp97/p47経路とp97/p37 経路が必要である。p97/p47経路は細胞分裂期における細胞内小器官の再構成に働き、もう一つのp97/p37経路は細胞周期間期における細胞内小器官の維持に働く。申請者は、p97/p47経路がゴルジ体形成に機能するための新規必須因子p55 を単離同定している。本研究では、そのp55の分子機構を明らかすることを目的とし、p97ATPase膜融合の新規必須因子p55を含む「機能的複合体」の単離同定を試みた。ラット肝臓から調製したゴルジ体膜を可溶化し抗p55抗体を用いた免疫沈降によりp55を含む複合体を単離した結果、約400kDaのタンパク質を得ることができた。このタンパク質を質量分析により解析した結果、ゴルジ体に局在するタンパク質Giantinであることが判明した。GiantinはNSF経路でtetheringに関係して機能することが知られている因子である。よって、Giantin/p55が、p97/p47経路において、tethering因子として機能する可能性が考えられた。この可能性を検証するため、可溶化したゴルジ体膜溶液をスクロース密度勾配遠心法により分画し、p55を含むGiantin画分のみから抗Giantin抗体とProteinG-beadsを用いてp55/Giantin-beadsを作製し、そのbeadsにp97やp47を加え、beads-Giantin/p55-p97-p47-p55/Giantin-beadsが形成されるかをbeadsのaggregationの観察によりおこなった。その結果、p97、p47両方を加えるとbeadsはaggregationし、p97単独やp47単独ではbeadsのaggregationは観察されなかった。また、p55を含まないGiantin画分を使用した場合では、p97、p47両方を加えても、beadsのaggregationは観察されなかった。よって、Giantin/p55-p97-p47-p55/Giantinという巨大な複合体が存在し、p97/p47経路において、tetheringとして機能している可能性が示唆された。