原発開放隅角緑内障の原因遺伝子(Myocilin)の機能解析

1)組み換えMyocilinの発現および精製Myocilinの特性等を明らかにするために、このタンパク質の発現・精製を試みた。条件検討を行った結果、大腸菌、酵母あるいは昆虫細胞ではタンパク質は発現しない、あるいは発現したとしても分解しだ。ところが、培養細胞であるCOS-1において発現させたところ、生産したタンパク質は培養液中に分泌され、そこから高純度のMyocilinを精製することが可能になった。2)Myocilinが相互作用する分子の探索培養液中に分泌したMyocilinはNIH3T3に特異的に結合することを明らかにした。そこで、Myocilinの機能を調べるために、Myocilinが結合する分子の同定を試みた。MyocilinをNIH3T3に結合させた後、架橋剤を反応させMyocilin-標的タンパク質複合体を形成させた。次に、抗Myocilin抗体を用いた免疫沈降実験を行ったところ、結合する因子として分子量30kDaのタンパク質が検出された。現在、この分子を同定するために質量分析計を用いた解析を行っている。3)Myocilinの結合によるNIH3T3への影響の調査通常の培養条件下では、Myocilinが細胞に結合することにより、細胞死等の大きな変化は生じなかった。そこで、緑内障発症に関与することが予想される種々の因子(酸化ストレス、ステロイド剤添加、および虚血)、を与えた時のMyocilinの影響を細胞の形態変化等を指標にして調べた。しかしながら、これらの要因から機能を推定することは困難であった。今後は、他の要因に関しても解析を続け、Myocilinの役割を明らかにする予定である。

1)組み換えMyocilinの発現および精製Myocilinの特性等を明らかにするために、このタンパク質の発現・精製を試みた。条件検討を行った結果、大腸菌、酵母あるいは昆虫細胞ではタンパク質は発現しない、あるいは発現したとしても分解しだ。ところが、培養細胞であるCOS-1において発現させたところ、生産したタンパク質は培養液中に分泌され、そこから高純度のMyocilinを精製することが可能になった。2)Myocilinが相互作用する分子の探索培養液中に分泌したMyocilinはNIH3T3に特異的に結合することを明らかにした。そこで、Myocilinの機能を調べるために、Myocilinが結合する分子の同定を試みた。MyocilinをNIH3T3に結合させた後、架橋剤を反応させMyocilin-標的タンパク質複合体を形成させた。次に、抗Myocilin抗体を用いた免疫沈降実験を行ったところ、結合する因子として分子量30kDaのタンパク質が検出された。現在、この分子を同定するために質量分析計を用いた解析を行っている。3)Myocilinの結合によるNIH3T3への影響の調査通常の培養条件下では、Myocilinが細胞に結合することにより、細胞死等の大きな変化は生じなかった。そこで、緑内障発症に関与することが予想される種々の因子(酸化ストレス、ステロイド剤添加、および虚血)、を与えた時のMyocilinの影響を細胞の形態変化等を指標にして調べた。しかしながら、これらの要因から機能を推定することは困難であった。今後は、他の要因に関しても解析を続け、Myocilinの役割を明らかにする予定である。