BKチャネル開口薬の探索

[BKチャネルの合成と蛍光標識]昆虫細胞の抽出液を用いて非細胞系でのBKチャネルタンパクの発現を試みた。現在まで真核生物のチャネルを無細胞タンパク合成系で作成した報告はほとんどないが、この方法が確立されれば非天然型アミノ酸の導入も容易であり特定の部位を標識でき、BKチャネルの構造と機能連関を詳細に調べることが可能になる。昨年まで発現が確認できたものは、短いものが多く、全長のものが得られなかった。そのためにsignal sequenceを挿入したが、結果的に大きな変化がなかった。今年度はWesternのための資料調製の条件を検討し、低温処理を施すことにより、今まで見えていなかった全長のBKチャネルを確認することができた。しかし、発現効率が低いという問題は残っており、今後の検討課題である。[BKチャネルの一分子イメージング]BKチャネル一分子の電気的・光学的同時計測のための基本的な装置はすでに出来ているが、本研究では、より安定した効率の良い計測装置の開発を行うことも目的としている。今年度はチャネルタンパクの不動化と再構築の効率化をはかるため、新しい方法をBKチャネルに応用した。ガラス表面をビオチン化したPEGでコーティングし、人工脂質膜に再構成したBKチャネル(豚の子宮から調製)を接近させた。その際、BKチャネルは一次、二次抗体、ビオチン・アビジン結合を介してビオチン化PEGと結合させた。BKチャネルの脂質膜上での動きはcy5で蛍光標識して調べ、抗体存在下でのBKチャネル一分子の不動化を確認することが出来た。PEGコートを用いた研究は、今年度、Langmuirに発表した。これらの方法を用いることにより、今後、一分子で一定時間安定して電気的・光学的同時計測を行えることが期待される。

[BKチャネルの合成と蛍光標識]昆虫細胞の抽出液を用いて非細胞系でのBKチャネルタンパクの発現を試みた。現在まで真核生物のチャネルを無細胞タンパク合成系で作成した報告はほとんどないが、この方法が確立されれば非天然型アミノ酸の導入も容易であり特定の部位を標識でき、BKチャネルの構造と機能連関を詳細に調べることが可能になる。昨年まで発現が確認できたものは、短いものが多く、全長のものが得られなかった。そのためにsignal sequenceを挿入したが、結果的に大きな変化がなかった。今年度はWesternのための資料調製の条件を検討し、低温処理を施すことにより、今まで見えていなかった全長のBKチャネルを確認することができた。しかし、発現効率が低いという問題は残っており、今後の検討課題である。[BKチャネルの一分子イメージング]BKチャネル一分子の電気的・光学的同時計測のための基本的な装置はすでに出来ているが、本研究では、より安定した効率の良い計測装置の開発を行うことも目的としている。今年度はチャネルタンパクの不動化と再構築の効率化をはかるため、新しい方法をBKチャネルに応用した。ガラス表面をビオチン化したPEGでコーティングし、人工脂質膜に再構成したBKチャネル(豚の子宮から調製)を接近させた。その際、BKチャネルは一次、二次抗体、ビオチン・アビジン結合を介してビオチン化PEGと結合させた。BKチャネルの脂質膜上での動きはcy5で蛍光標識して調べ、抗体存在下でのBKチャネル一分子の不動化を確認することが出来た。PEGコートを用いた研究は、今年度、Langmuirに発表した。これらの方法を用いることにより、今後、一分子で一定時間安定して電気的・光学的同時計測を行えることが期待される。