癌分子標的治療にむけたホスホプロテオミクス技術に基づくシグナル伝達システムの同定

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本年度は、質量分析計によって計測した野生型EGFR発現細胞および変異型EGFR(Y992F)発現細胞シグナル伝達の時系列情報を再現する数理モデルの構築、及び数理モデル予測の実験による検証を行った。EGFRシグナル伝達計算機モデルのパラメーター(生化学反応の係数,及びタンパク質の発現量)の推定はサブペタスケールコンピュータを用いてモンテカルロ粒子フィルタ法を繰り返し適用することにより達成した。次に構築した数理モデルを用いてシグナル伝達動態の差異の原因となるパラメーター変化を探索した。その結果、細胞間のタンパク質発現量の違いおよびいくつかの生化学反応速度の違いが大きな寄与をしていると予測された。予測されたタンパク質発現量の差異、および生化学反応速度の変化を実細胞を用いて検証したところ、計算機モデルの予測を支持する結果が得ることができた。さらに、野生型EGFR発現細胞には影響を与えず、変異型EGFR発現細胞のシグナル伝達を正常化する薬剤標的分子を数値実験により探索した。その結果、特定の脱リン酸化酵素を候補分子として得ることができた。今後、ノックダウンおよび阻害剤を用いた実験によって候補分子の薬剤標的としての有用性を検証して行く予定である。加えて、計算機実験と並行し各種EGFR変異体を安定発現した細胞株をFlp-in Systemを用いて樹立した。ホスト細胞としてNIH3T3細胞を用いた。自己リン酸化部位の変異及び、がん細胞で顕著に観察される変異を野生型EGFRプラスミドに導入した。EGFRプラスミドとFLP recombinaseプラスミドをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、薬剤選択した後にクローニングを行った。EGFRの発現解析を行ったところほぼ全てのクローンで同程度のEGFRの発現があることが確認された。今後、本細胞株をリン酸化プロテオミス解析し、変異によるEGFRシグナル伝達異常の定量的解明を進める。